一种动态范围优化的Western Blot流程用于可靠定量小鼠脑髓鞘蛋白表达及其在神经发育研究中的应用

本研究系统优化了Western Bllot（WB）技术流程，通过改进样本制备、电泳转移条件与检测参数，显著提升了髓鞘蛋白（如MOG、MBP、PLP）的定量准确性与动态范围。创新性引入动态上样策略（Dynamic Loading），有效克服传统等量上样（Standard Loading）的检测饱和限制，为神经发育（Neurodevelopment）、髓鞘形成（Myelination）及相关疾病机制研究提供更可靠的蛋白定量方案。

　　

摘要

髓鞘是由少突胶质细胞（Oligodendrocytes, OLs）产生的高度结构化的多层膜结构，其通过绝缘神经元轴突促进神经传递。小鼠大脑皮层区域少突胶质细胞的成熟发生在出生后，并与髓鞘特异性基因的显著上调相对应。Western Blot（WB）是研究蛋白质表达的常规技术，但历史上仅被认为是半定量的。本研究旨在优化用于定量小鼠脑中髓鞘蛋白的WB工作流程，包括检查以下参数：样品制备、电泳转移条件、检测参数、数据标准化和线性动态范围（Linear Dynamic Range, LDR）。作为原理验证，优化方案被用于表征神经发育过程中髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein, MOG）的绝对和相对表达。动态上样范式（Dynamic Loading Paradigm）在不同年龄组中改变总蛋白上样量，以确保抗原检测保持在测定的线性动态范围内，与标准上样范式（Standard Loading Paradigm）相比，显示出更大的相对表达增加。这种方法在绝对和相对定量中产生了可比的MOG表达谱。优化的WB工作流程将有助于蛋白质定量，并在研究发育、衰老和疾病中髓鞘形成的分子机制时提高数据可重复性。

引言

髓鞘是一种多层紧密的膜结构，用于绝缘轴突并促进跳跃性神经传导。在大脑皮层区域，少突胶质细胞（OLs）延伸众多突起，每个细胞可髓鞘化多达50个轴突段。在啮齿类动物的神经发育过程中，皮层和胼胝体的动态髓鞘化过程大约在出生后第11天（P11）开始，P21达到高峰，并持续到成年期。少突胶质细胞转录因子2（Oligodendrocyte Transcription Factor 2, OLIG2）通常被用作全谱系标志物，而少突胶质细胞祖细胞（Oligodendrocyte Progenitor Cells, OPCs）向成熟的髓鞘化胶质细胞的进展则由关键蛋白的表达来描绘。OPCs表达血小板衍生生长因子受体α（Platelet Derived Growth Factor Receptor Alpha, PDGFRα），其抑制与向有丝分裂后的未成熟OLs分化开始相吻合。Sirtuin 2（SIRT2）和2′,3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶（2′,3′-Cyclic Nucleotide 3′-Phosphodiesterase, CNP）在髓鞘形成前阶段早期和整个髓鞘形成过程中表达。在成熟过程中，髓鞘结构蛋白如髓鞘碱性蛋白（Myelin Basic Protein, MBP）、蛋白脂质蛋白（Proteolipid Protein, PLP）、髓鞘相关糖蛋白（Myelin Associated Glycoprotein, MAG）和髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）的表达也增加。这些阶段特异性标志物的定量为研究OL分化和髓鞘化的分子机制提供了可靠的衡量标准。

Western Blotting是一种用于在蛋白质水平研究基因表达的常用技术。蛋白质被变性，在凝胶基质中分离，并固定到膜上以便对特定蛋白质靶标进行免疫检测。该技术因其高特异性和灵敏度而具有优势，其中抗原检测可在amol水平实现。历史上，由于缺乏严格的验证步骤和方法学报告不足，Western Blotting存在可重复性问题。对于抗原的绝对或相对定量，应满足几个条件。首先，应验证抗体对靶抗原的特异性。其次，应有效提取和转移靶蛋白。第三，应评估使用总蛋白或稳定参考蛋白的负载归一化方法。第四，应确定给定样品的抗原检测与蛋白质上样量的线性动态范围（LDR）。Western Blot的一个主要限制是狭窄的动态范围，这主要源于检测化学的局限性以及膜或检测器的饱和。典型的Western Blot工作流程采用每泳道等量蛋白质上样（即标准上样），容易饱和，而为每个实验组改变蛋白质量（即动态上样）可用于保持在测定的动态范围内。动态上样策略先前已被用于解决这一限制，用于定量大鼠脑中的大麻素1（Cannabinoid 1, CB1）受体、大鼠肌肉组织中的钙螯合蛋白以及人子宫肌层活检中的外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1（Ectonucleotide Pyrophosphatase/Phosphodiesterase 1, ENPP1）。

本文系统地优化了用于从小鼠脑组织定量髓鞘蛋白的Western Blot工作流程，旨在提高可重复性、准确性和常规分析的实用性。优化了工作流程每个步骤的方法学参数，以及评估蛋白质表达巨大变化的动态范围的实际限制。通过在不同实验年龄组中使用动态上样范式，该方法捕获了出生后发育过程中MOG蛋白质表达轨迹的更大倍数变化。与等量蛋白质的标准上样相比，动态上样显示与绝对定量更好的一致性，用于髓鞘蛋白的相对归一化表达。优化的方法将为检查髓鞘化和再髓鞘化研究中动态蛋白质表达提供一个直接的指南。

材料与方法

化学品与试剂

用于蛋白质定量的抗体详见表1（图S1–S2）。脱氧胆酸钠（NaDC）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Triton X-100（TX-100）、三（羟甲基）氨基甲烷（Tris）、三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、氯化钠（NaCl）、正磷酸、Tween-20、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-[4-（2-羟乙基）哌嗪-1-基]乙烷-1-磺酸钠（HEPES）、过硫酸铵（APS）、溴酚蓝（BPB）、硫酸铵、考马斯亮蓝G-250（CBB）、乙酸、二硫苏糖醇（DTT）和Pierce?蛋白酶抑制剂（PI）购自Fisher Scientific。Precision Plus Protein?未染色标准品（#1610363）、Precision Plus Protein? All Blue预染色蛋白质标准品（#1610373）、β-巯基乙醇（#1610710）、30%丙烯酰胺/双丙烯酰胺（37.5:1）溶液（#1610158）、Tris-甘氨酸扩展（TGX）Stain-Free? FastCast? 12%丙烯酰胺试剂盒（#1610185）、0.2 μm硝酸纤维素膜（#1620146）、0.2 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（#1620177）、Trans-Blot Turbo Mini 0.2 μm硝酸纤维素转移包（#1704158）和Clarity? Western增强化学发光（ECL）底物（#1705061）购自Bio-Rad。Amersham Hybond 0.2 μm低荧光PVDF（#10600022）和Whatman 3 MM Chr色谱纸（#30306185）购自Cytiva。彩色预染色蛋白质标准品（#P7712）购自New England Biolabs。全长重组小鼠MOG蛋白（#TP503094）购自Origene。牛血清白蛋白（BSA; #A9647）购自Sigma–Aldrich。甲醇（#C20903.550）购自VWR。

动物

C57BL/6J（RRID:IMSR_JAX:000664）繁殖种群购自Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME），并在北不列颠哥伦比亚大学维持一个种群。所有实验程序（#2020-16）均经机构动物护理和使用委员会批准，并符合加拿大动物护理委员会指南。小鼠饲养在12小时光/暗循环（7:00至19:00小时）的房间中，可自由获取标准啮齿动物饲料（#5001, LabDiet, Inc., St. Louis, MO）和水。成年雄性和雌性小鼠（3-6个月）的脑组织用于方法优化。对于发育基因表达，一个半球的大脑组织（皮层、胼胝体和海马）用于先前研究中的mRNA表达分析，另一个半球用于本研究中的蛋白质表达分析（P0,