蕨类配子体氮通量性别差异揭示营养驱动的性别决定机制

本研究利用微电极离子流测量（MIFE）系统，首次揭示了剑蕨（Polystichum munitum）配子体存在显著的氮吸收性别差异。研究发现配子体整体表现为铵（NH4+）和质子（H+）净流入，而硝酸盐（NO3?）呈现净流出。雄性配子体单位面积NH4+吸收更强，但雌/雌雄同体配子体整体吸收量更高，这为环境性别决定（ESD）理论提供了生理学证据。

　　

引言

同型孢子蕨类配子体的性别分化受环境因素显著影响。配子体在孢子萌发后经细胞分裂形成，性成熟后可分为功能性雄性、雌性或雌雄同体。雄性配子体通常远小于雌性或雌雄同体个体，其性别决定发生在孢子萌发后，受外部因素调控。在 Woodwardia radicans 中，营养限制或拥挤条件会影响性别表达：低密度或高营养的优良条件促使配子体发育为较大的雌性，随后转为两性；而恶劣条件则使配子体在较小体型时成熟为雄性。这种可塑性性别决定机制符合 Charnov 和 Bull 提出的"斑块环境模型"和"体型优势模型"理论框架。本研究由此提出核心问题：较小雄性配子体与较大雌性/雌雄同体配子体是否存在营养吸收差异？

方法材料

配子体培养采用维多利亚大学校园采集的 Polystichum munitum 繁殖叶，孢子经干燥处理后储存于4°C。无菌土壤经70°C热处理后播种孢子，并在光照培养箱中维持培养条件。

离子流测量使用非侵入式微电极离子流测量系统（MIFE），在2023年10月至2024年9月期间进行。性成熟配子体从土壤中分离后固定于Perspex支架，置于含500μmol/L NH₄NO₃和200μmol/L CaSO₄·2H₂O的测量溶液中，分别在pH5和pH7条件下进行适应。微电极经硅烷化处理后填充相应离子选择性 cocktails，精确布置于配子体边缘进行测量。每个配子体测量约8分钟，取稳定3分钟时段计算平均通量。

生物量与统计分析中，所有配子体经60°C干燥后使用微量天平称重。通过高分辨率图像计算10个雄性和10个雌性配子体表面积，建立干重与表面积的线性回归模型。离子通量数据乘以表面积和86400秒转换系数计算每日吸收率，采用方差分析（ANOVA）比较性别和pH的效应。

结果

雌性/雌雄同体配子体干重（0.545±0.059 mg）显著大于雄性（0.017±0.002 mg）。单位面积NH₄⁺吸收在性别间无显著差异，且不受pH影响，但pH7条件下平均值较低。NO₃^?表现为净外流，pH5条件下的外流显著高于pH7，雄性平均外流率更高。H⁺通量受性别和pH双重影响，雄性在pH5条件下质子吸收显著更强。

表面积与生物量关系显示雌性为70.1 mm²/mg，雄性为37.7 mm²/mg。较大的生物量和表面积比例使雌性配子体每日离子吸收/流失总量显著更高。雌性NH₄⁺日吸收量在两种pH条件下均显著高于雄性。pH5条件下雌性NO₃^?流失量较高，但雄性及pH7条件下雌性流失量不显著。两种性别在pH5条件下均表现质子吸收，pH7条件下则转为质子流失，且雌性变化幅度更大。

讨论

本研究证实剑蕨配子体营养吸收通过整个表面进行，与苔藓植物类似而非具维管组织的孢子体。实验结果支持配子体优先吸收NH₄⁺而非NO₃^?的假设，与多数苔藓配子体行为一致。NH₄⁺单位面积吸收无性别差异且不受pH影响的特点，与 Pseudotsuga menziesii 和 Pinus contorta 根系行为相似。这种偏好可能源于NH₄⁺同化的较低能量成本，与水蕨 Salvinia natans 孢子体的观察结果一致。

NO₃^?净外流现象与假设相悖，表明配子体行为不同于典型根系。雄性在pH7条件下外流更显著，而pH5条件下性别差异消失。这种与种子植物根系和苔藓配子体的差异可能源于配子体生长缓慢、氮需求低的特点，以及有限的内部营养物质转运能力。我们推测缓慢的生长速率导致氮同化率低，通过能量成本较低的NH₄⁺吸收即可满足需求，致使代价较高的NO₃^?同化或储存被规避。

配子体普遍表现H⁺流入且受性别影响，与种子植物根系和苔藓的H⁺外流模式形成对比。pH5条件下雄性质子流入显著更强，而pH7条件下性别差异减小且通量降低。这可能源于缓慢生长配子体的细胞扩张有限，酸生长反应缺失，或为维持低质外体pH以平衡NH₄⁺吸收和同化引起的胞质pH碱化。

关于体型优势假设的验证呈现尺度依赖性：雄性单位面积NH₄⁺吸收更高，但考虑整体表面积后，雌性/雌雄同体配子体表现出显著更高的NH₄⁺日吸收量、NO₃^?外流量和H⁺吸收量。这表明在整体生物水平上，支持颈卵器发育的配子体具有更高的氮需求。Ceratopteris richardii 的研究同样发现预定发育为大型雌性的分生配子体比预定为小型雄性的非分生配子体具有更高的总氮百分比，符合营养基础的环境性别决定理论。

性别影响配子体生理的机制可能涉及Antheridiogens（成精子器素）的作用。虽然 Polystichum munitum 中尚未直接研究此类激素，但该属其他物种已证实存在这种调控机制。这种激素调控不仅诱导雄性配子体形成，还延伸至受精后的发育事件：合子形成后雌性配子体停止Antheridiogen生产，释放周边未成熟配子体的发育抑制，使其继续生长并发育为具颈卵器和精子器的雌雄同体。

本研究技术方法为研究其他具独立交替世代植物（如其他蕨类和石松类）的营养通量提供了范本。这些植物的配子体生存环境多样（陆生、附生、地下生长甚至咸水环境），其适应机制值得深入探索。分子机制方面，NO₃^?和NH₄⁺膜转运蛋白在植物孢子体及其他生物中已有深入研究，但单倍体配子体世代的生理机制所知甚少。比较雄性与雌性/雌雄同体配子体膜转运蛋白的分子遗传和转录组学研究，将是极具价值的研究方向。