大麻幼苗乙烯敏感性分析揭示三重反应样表型及其在性别可塑性中的保守信号通路

本研究开发了一种基于乙烯利（ethephon）的测定方法，成功在黑暗条件下诱导工业用和药用大麻幼苗中观察到独特的三重反应样表型，包括下胚轴和胚根缩短以及下胚轴增厚。该研究规避了气态乙烯的操作难题，为早期发育中乙烯信号通路（ERGs）的研究提供了简便工具。研究证实低浓度乙烯利（125–500 mg/L）即可引发强烈反应，且乙烯抑制剂硫代硫酸银（STS）能一致逆转该表型，支持乙烯信号在大麻遗传背景中的保守性。该发现为解析乙烯调控大麻性别可塑性（sexual plasticity）的分子机制奠定了基础。

　　

引言

大麻（Cannabis sativa L.）作为一种具有千年栽培历史的多用途植物，近年来因其雌花中富含的大麻素类次生代谢物（如四氢大麻酚THC和大麻二酚CBD）而备受关注。作为一种二倍体（2n=10）雌雄异株植物，大麻具有XX/XY性染色体系统，但其高度杂合的基因组和缺乏类似拟南芥的快速表型筛选工具，限制了其分子机制研究的进展。本研究旨在建立一种简单、低技术门槛的测定方法，用于鉴定大麻幼苗的乙烯不敏感性，类似于拟南芥中的三重反应测定。

乙烯作为一种广泛研究的植物生长调节剂，在植物生物学中具有多重效应，包括应对生物和非生物胁迫、果实成熟、种子发育以及花器官形成和性别决定。在大麻中，乙烯最近被确认为性别可塑性的关键调节因子。性别可塑性在具有性染色道的雌雄异株植物中表现为表型性别与基因型性别不一致的现象。在黄瓜等葫芦科植物中，乙烯已明确具有 feminizing 特性，能够提高雌雄花比例。相反，抑制乙烯产生或信号传导则会导致雄花比例增加。硫代硫酸银（STS）作为内质网定位乙烯受体的抑制剂，已应用于XX大麻植株以诱导产生雄花，从而通过自花授粉生产纯合XX（女性化）种子。反之，使用2-氯乙基膦酸（乙烯利）处理XY大麻植株可诱导雌花形成，表明乙烯在性别可塑性中具有双向调节作用。

尽管在开花期成熟植株中研究乙烯调节是一种可行方案，但大麻从种植到成熟超过4个月的生长周期限制了研究效率。幼苗系统为研究乙烯响应提供了快速替代方案，但目前尚缺乏筛选大麻幼苗乙烯敏感性的标准方法，阻碍了乙烯相关基因（ERGs）的研究进展。

“三重反应”由植物生理学家Dimitry Neljubow首次描述，是指在黑暗条件下生长的黄化幼苗在乙烯存在下表现出的三种典型表型变化：下胚轴增粗、下胚轴和根伸长受抑以及顶端钩 exaggerated。该反应在双子叶植物和部分单子叶植物中高度保守，且易于视觉识别。在拟南芥中，幼苗对乙烯高度敏感，即使乙烯生物合成或信号传导的细微改变也会引发明显反应，因此三重反应测定被广泛用于ERGs的研究。开发类似的大麻测定方法将为其ERGs研究提供宝贵工具。

乙烯的气态特性使其处理复杂化，需要密闭环境和敏感设备。使用乙烯利等水性乙烯形式可简化大麻幼苗中乙烯诱导表型的研究。乙烯利在成熟植株中已显示可引发乙烯响应，有效浓度范围为500至1920 mg/L。尽管在玉米和羽扇豆等物种中已有乙烯利处理幼苗的报道，但尚未有大麻幼苗的相关研究。本研究首次在工业用（THC<0.3%）和药用（THC>0.3%）大麻背景下证明了乙烯利诱导的三重反应样表型，通过使用乙烯利作为乙烯源，为早期研究大麻乙烯响应提供了一种快速、简便的方法。

材料与方法

本研究采用随机区组设计，每个培养皿作为一个区组包含五粒种子。处理在区组内随机分配以最小化环境变异。实验分三个连续阶段进行，每个阶段为下一阶段优化处理条件。独立培养皿作为生物学重复，区组结构控制变异性。统计分析采用线性混合效应模型（LMM）来解释培养皿之间和种子之间的变异性。

乙烯利和硫代硫酸银的制备：乙烯利根据Moon等人（2020）的方法从40%商品原液（AK Scientific）配制为500 mg/L（3.46 mmol/L）溶液，使用含1% Tween 20的蒸馏水配制，避光室温保存最多1个月。按需制备250 mg/L（1.73 mmol/L）和125 mg/L（0.87 mmol/L）系列稀释液。STS根据Jones和Monthony（2022）的方法新鲜配制，使用前将硫代硫酸钠（24 mmol/L）和硝酸银（6 mmol/L）储备液按1:1比例混合，获得3 mmol/L STS + 0.1% Tween 20工作液。储备液用蒸馏水配制，最多保存3个月。

第一部分：工业用大麻中乙烯利浓度的优化：测试四种乙烯利浓度（0、125、250和500 mg/L）以确定诱导工业用大麻品种“Vega”幼苗三重反应样表型的最佳浓度。每个处理设三个生物学重复（三个培养皿），每皿五粒种子（n=15）。种子在50 mL相应乙烯利溶液中浸泡12小时后，播种于方形培养皿（Fisherbrand）内湿润的棉花上。培养皿直立放置，半填棉花（Medline），种子置于其上。播种前用相同乙烯利溶液湿润棉花，密封前用蒸馏水喷雾（每皿15喷，约6-7 mL）。培养皿用聚氯乙烯（PVC）密封膜（PhytoTech Labs）密封，黑暗条件下直立放置7天。

第二部分：STS对工业用大麻乙烯利响应的抑制：基于第一部分确定250 mg/L乙烯利为诱导三重反应样表型的最佳浓度，本实验测试STS能否抑制该响应。设置五种处理组合：0 mmol/L STS/0乙烯利、0 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利、1 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利、2 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利和3 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利。0 STS/250 mg/L乙烯利处理用于验证第一部分结果的可重复性。每个处理设三个生物学重复，每皿五粒种子（n=15）。培养皿制备方法同第一部分，关键区别在于喷雾溶液：使用相应浓度的STS溶液（1、2或3 mmol/L）替代蒸馏水，每皿喷雾15次（6-7 mL）。棉花根据处理用0或250 mg/L乙烯利浸泡。

第三部分：药用大麻的验证：为验证前两部分结果在药用大麻中的适用性，测试先前确定的最佳浓度。最终处理包括0 mmol/L STS/0 mg/L乙烯利、1 mmol/L STS/0 mg/L乙烯利、0 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利和1 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利。为增加统计效力，每个处理设五个生物学重复（五个培养皿），每皿五粒种子（n=25）。为增强广泛适用性，种子随机选自LaPierre等人（2023b）的79种不同基因型的多样化群体。培养皿制备同前两部分，实验遵循相同的7天黑暗培养期。

数据收集：第7天评估形态性状，包括下胚轴宽度、长度、胚根长度和顶端钩角度。使用三星NX100相机对幼苗个体拍照，并通过ImageJ（v1.54d）软件进行分析，方法如Page等人（2021）所述。设定标尺后，使用直线工具测量下胚轴宽度，自由线工具 tracing 下胚轴和胚根长度。顶端钩角度使用ImageJ中的角度工具进行三次测量。所有线 tracing 均使用Wacom Intuos数位板完成。

数据分析：所有统计分析使用R（v4.3.3）在RStudio环境（v2024.04.2 Build 764）中进行。分析代码和原始数据可在Open Science Framework（https://doi.org/10.17605/OSF.IO/YBQ7F）获取。分析评估乙烯利和STS对黄化大麻幼苗三重反应性状的独立和联合效应，测量下胚轴长度、宽度、胚根长度和顶端钩角度。使用nlme包的“lme”函数构建LMM，以乙烯利和STS作为固定因子。培养皿作为随机效应以解释变异性，而培养皿内嵌套的种子也作为随机效应以捕捉层次数据结构。对于顶端钩角度，将培养皿内嵌套的种子重复测量作为随机效应。通过检查残差的正态性和方差齐性验证LMM假设。使用自定义函数（“ScaledResid”）缩放残差并校正任何协方差结构。通过 quantile–quantile 图视觉评估残差正态性，并使用Shapiro–Wilk检验进行定量评估。使用Levene检验（car包）评估固定因子间的方差齐性。

若检测到假设违反，则应用数据变换（包括秩变换）并重新评估。比较未变换和变换模型以确保稳健性。若两者结果相似，则使用未变换数据以简化和可解释性。通过LMM识别的显著主效应和交互作用使用Tukey's HSD检验（emmeans包）进行探索。使用 compact letter displays（multcompView包）清晰可视化处理组差异。使用ggplot2包进行数据可视化，并结合 compact letter displays 说明统计显著性。

结果

所有测试的乙烯利浓度均在工业用大麻幼苗中诱导出相同的三重反应样表型，其特征为与对照组相比下胚轴和胚根缩短以及下胚轴增厚。值得注意的是，虽然所有乙烯利处理（500、250和125 mg/L）与对照（0 mg/L）均存在显著差异，但处理间在下胚轴或胚根长度或下胚轴宽度方面未检测到显著差异。当比较未处理种子与250 mg/L乙烯利处理种子的生长时，发现未处理种子的平均下胚轴和胚根长度约为乙烯利处理幼苗的两倍。250 mg/L乙烯利处理幼苗的下胚轴宽度与未处理幼苗相比增加一倍，测量值为2.22 cm对1.15 cm。在任何乙烯利处理中均未观察到与对照相比的顶端钩 exaggerated。选择250 mg/L乙烯利浓度用于后续实验，因其在黑暗生长幼苗中有效诱导三重反应样表型。

当与不同浓度STS联合测试时，乙烯利诱导的三重反应样表型被有效抑制。所有STS浓度产生相似水平的抑制；所得表型与未处理的黄化幼苗无法区分。在任何处理中均未观察到顶端钩角度的变化。选择1 mmol/L STS浓度用于药用大麻种子的进一步评估，因其在统计和定性上产生的幼苗表型最接近未处理对照。

最后，探讨了STS单独及与乙烯利联合对药用大麻幼苗的效应。当单独应用时，发现STS对黑暗萌发幼苗的黄化没有影响。然而，用250 mg/L乙烯利处理黑暗萌发幼苗诱导出与工业用大麻幼苗中观察到的三重反应样表型。该表型显示下胚轴和胚根长度显著减少，同时下胚轴显著增粗。STS和乙烯利在药用大麻幼苗中的应用产生了与工业用大麻对应物相同的响应，恢复了黄化表型。与工业用大麻幼苗中发现一致，未观察到顶端钩角度的变化。

讨论

本研究探讨了乙烯（以乙烯利形式应用）对黑暗萌发黄化大麻幼苗的效应，重点关注下胚轴和胚根的表型响应以及顶端钩形成，如先前在拟南芥中所述。大麻表现出广泛的性别表达谱，从药用基因型的雌雄异株到工业用大麻品种的单态和双态形式。雌雄异株基因型显示性别可塑性：即产生与其染色体性别相反的生殖器官。虽然乙烯已被 linked 到这种可塑性，但其分子信号传导机制仍未知。理解大麻中的乙烯信号传导对生产者至关重要，特别是在开发性别稳定品种以降低商业栽培风险方面。幼苗中快速简便的乙烯敏感性测定可促进性别可塑性背后分子机制的研究。

乙烯敏感性测定已在拟南芥、豌豆和羽扇豆等物种的黄化幼苗中开发。在这些物种中，暴露于乙烯的黑暗萌发幼苗表现出三重反应，其特征为下胚轴和胚根缩短、下胚轴肿胀和 exaggerated 顶端钩。类似地，本研究发现用乙烯利处理的大麻幼苗中出现三重反应样表型，其特征为下胚轴和胚根缩短和下胚轴肿胀，但没有 exaggerated 顶端钩。这种变异表明，虽然乙烯信号通路在大麻中 largely 保守，但可能存在独特的调节机制， potentially 解释 exaggerated 顶端钩的缺失。

乙烯对下胚轴伸长效应的分子基础在拟南芥中 well-characterized。乙烯在黑暗或低光（<10 μmol m^?2 s^?1）条件下抑制下胚轴生长，但在光照良好环境中促进伸长。乙烯的这种双重作用由乙烯不敏感3（EIN3）和乙烯响应因子1（ERF1）介导，其中乙烯在黑暗中增加EIN3水平，激活ERF1并抑制生长。我们的发现显示所有乙烯利浓度下下胚轴伸长均显著减少，表明这种EIN3–ERF1介导的抑制在大麻中保守。

本研究检查了乙烯利对大麻幼苗的效应，填补了关于生物响应最佳浓度的文献空白，该领域主要在成熟植株中研究。我们显示大麻幼苗对乙烯利的敏感性高于影响成熟植株所需的浓度，且在这些降低的水平上没有显著变异。这与先前对成熟大麻的研究形成对比，后者需要更高浓度（500–1920 mg/L）和更短暴露时间以引发生理响应。尽管乙烯利提供了气态乙烯的可及替代品，但其转化效率和短半衰期（pH 7下11–48小时）需要 prolonged 暴露以实现有效乙烯释放。本研究中使用的7天暴露确保了持续乙烯可用性，最大化其生理影响。浓度和暴露时间的重要性由在125和250 mg/L获得的表型响应强调，这些浓度在成熟植株中被认为无效。幼苗可能由于其相对于应用剂量的较低生物量，加上延长暴露时间而更具响应性。在最高测试浓度（500 mg/L），幼苗表现出与较低剂量相似的表型，表明对乙烯利的敏感性范围广泛，没有 prolonged 暴露或增加浓度引起的植物毒性迹象。

比较大麻幼苗与其他物种的幼苗突出了它们对乙烯利的高度敏感性。例如，白羽扇豆幼苗显示剂量依赖的下胚轴生长抑制，乙烯利浓度范围从0.66 mmol/L（～95 mg/L）到6.6 mmol/L（～954 mg/L）。虽然最高乙烯利浓度导致24小时后持续抑制，但最低浓度仅导致 transient 生长抑制。在玉米等单子叶植物幼苗中，报道了4天暴露于0.001 mmol/L（～0.15 mg/L）至1.2 mmol/L（～173 mg/L）乙烯利后剂量依赖的生长迟滞和中胚轴粗糙度增加。这些发现与我们在大麻幼苗中的观察一致，其中所有测试浓度在7天内导致生长减少。这强化了成熟植株可能对较低乙烯利浓度较不敏感，而幼苗高度响应的观点，表明较低浓度可在早期发育阶段有效引发生理响应。

我们证明了应用STS（一种已知的乙烯信号传导抑制剂）完全逆转大麻三重反应样表型。STS中的银离子（Ag⁺）与内质网上乙烯受体蛋白的铜离子结合位点结合，抑制乙烯结合并阻止下游乙烯响应基因表达。1和2 mmol/L STS statistically 显著完全逆转乙烯诱导表型进一步支持大麻中保守乙烯信号传导机制的假设。然而，3 mmol/L STS/250 mg/L乙烯利处理产生中间表型，平均下胚轴长度（25.3 mm）更接近未处理幼苗（30.5 mm）而非仅乙烯利对照（7.6 mm）。较高浓度STS导致仅部分缓解， potentially 暗示未知生物效应；更可能的是中间表型反映了样本量限制和降低的统计效力。建议跨多个大麻栽培品种进行进一步转录组和代谢组分析以验证这些发现，特别是考虑到该物种先前 documented 对其它植物生长调节剂的体外响应变异性。

萌发幼苗中顶端钩的形成对于保护分生组织在土壤 emergence 过程中至关重要，并且其发育已知受机械压力、乙烯和生长素梯度等因素影响，如在拟南芥中 demonstrated。然而，作为乙烯诱导三重反应一部分常见的 exaggerated 顶端钩并非跨物种普遍。在瘦果 producing 植物中，光照而非乙烯可能 primarily 驱动顶端钩 exaggerated 以帮助 emergence 过程中种皮脱落。由于大麻是瘦果 bearing 物种，这可能解释了乙烯利处理幼苗中 exaggerated 顶端钩的缺失，尽管下胚轴长度显著减少和厚度增加。顶端钩 exaggerated 的缺失反映了番茄和玉米中的发现，其中乙烯对顶端钩的影响在某些条件下最小或可逆。这些差异强调了乙烯在幼苗发育中响应的物种特异性。虽然确切原因仍不清楚，但 prolonged 或更高剂量乙烯利处理可能产生不同效应，或大麻可能表现出与番茄和玉米相似的不完全三重反应。此外，本研究中使用的相对较小样本量， combined 观察到的较大平均标准误，可能限制了我们检测顶端钩角度细微但 statistically 显著差异的能力。未来具有更大样本量和 varied 处理的研究对于明确表征乙烯在大麻顶端钩形成中的作用至关重要。

在工业和药用型大麻幼苗中观察到的乙烯利处理后三重反应样表型标志着理解乙烯在该物种中作用的关键一步。本研究建立了一种简单、视觉可区分的方法用于评估乙烯敏感性，为在研究和商业应用中使用乙烯利提供了实用指南。通过证明较低乙烯利浓度与 prolonged 暴露有效引发乙烯响应，该方法消除了对乙烯气体的需求。

结论

随着大麻中ERGs研究的扩展，理解乙烯在性别可塑性中的作用变得越来越相关。本研究首次证明了暴露于乙烯的黑暗萌发大麻幼苗中的三重反应样表型。通过引入基于乙烯利的测定，我们提供了一种无需专门气体处理设备即可研究乙烯响应的可及方法。我们的发现确认了跨多样化大麻遗传背景（包括工业和药用品种）的广泛乙烯敏感性。此外，完全的STS介导表型逆转支持保守乙烯信号通路的存在。然而， exaggerated 顶端钩的缺失表明瘦果 bearing 植物中存在 distinct 调节机制，值得进一步调查。该测定为探索乙烯在大麻中的作用提供了宝贵工具，特别是在调节性别可塑性方面。对这些机制的更深入理解将对大麻栽培和育种产生深远影响，实现更精确的植物发育和繁殖策略操纵。通过阐明乙烯对大麻的影响，本研究为未来研究大麻中激素信号传导和性别分化的复杂相互作用奠定了基础。