高遗传多样性北极植物Bistorta plumosa（两栖白令种）的系统地理学研究揭示其长期稳定分布与冰川避难所历史

本研究通过分析两栖白令地区北极草本植物Bistorta plumosa的叶绿体DNA（cpDNA）遗传结构，揭示了该物种在Bistorta officinalis复合群中的独立地位及其惊人的高遗传多样性（单倍型多样性?=0.929，核苷酸多样性π=0.0060）。研究表明，B. plumosa自末次盛冰期（LGM）以来分布范围稳定，未发生大规模迁移，其遗传模式凸显了北极苔原植物响应历史气候变化的多样性，为北极生物区系演化与避难所（refugia）研究提供了关键案例。

　　

Abstract

当前北极植物区系的地理起源十分复杂。遗传结构研究为此提供了重要见解，但现有研究仍基于过少的物种。Bistorta officinalis复合群是一类认知不足但广泛分布于北半球高山和北极地区的植物类群，其中包括北极苔原物种Bistorta plumosa（Small）Greene，分布于北美西北部和东亚。本研究对来自育空、阿拉斯加和俄罗斯的73份B. plumosa及相关物种样本进行了两个质体DNA区域的测序，进行了贝叶斯系统发育分析，并分析了B. plumosa的系统地理变异。结果表明，B. plumosa在B. officinalis复合群中代表一个独立的两栖白令谱系。我们在B. plumosa内发现了显著的高遗传多样性，高于大多数已研究的白令植物物种，并与其它长期存在于北极栖息地的物种相似。B. plumosa当前的地理范围主要局限于未冰盖区域，但在采样范围的所有部分均表现出高水平的遗传多样性，表明至少自末次盛冰期以来其分布范围变化很小。这与许多北极苔原物种形成对比，并强调了可能导致相似地理范围的更新世后范围扩张模式的多样性。

Introduction

当今北极苔原植物区系的组装是一个渐进过程，组成该区系的物种在地理分布和迁移历史上差异很大。苔原栖息地大致在新近纪约3 Ma（百万年前）开始在北极地区广泛分布，并在随后一直广泛存在，尽管受到更新世冰川作用的强烈影响。北极地区的变冷趋势早在8–9 Ma就已显现。当今北极生物群的许多要素在这一时期早期就已到达，随着北极苔原逐渐变得更加连续和广泛。近期研究表明，组成环极地区植物区系的分类群大多是在不同时间从温带谱系独立产生的。Zhang等人（2023）利用多个被子植物支系的定年系统发育研究发现，对北极地区的殖民约始于10 Ma，在约6 Ma后增加，并持续到更新世。他们表明，一些北极谱系从低纬度扩散而来，另一些则在原地多样化；到达北极的时间以及随后的传播和多样化模式在所评估的谱系间差异很大。许多北极谱系的起源仍然未知，且大多数北极苔原植物的种群遗传结构知之甚少。分子数据使得检验关于其起源、迁移路径和在避难所中持久性的特定假设成为可能。

在更新世期间，随着冰川循环使北极物种经历反复的范围变化，苔原栖息地的范围也随之变化。遗传多样性模式为这些变化提供了证据，揭示了扩散路线、范围扩张和收缩，以及在北极和低纬度山地避难所中的持久性。Hultén（1937, 1958）认为北极物种通过从多个避难所进行范围扩张，反复实现了环极分布。几个北极-高山物种的这种避难所实例已被确定。在保持无冰的北部地区，苔原栖息地的连通性和范围可能在冰期期间增加。白令地区（现今的西北育空至东西伯利亚）在更新世期间提供了一个大的高纬度无冰区，并长期以来被提议作为许多北极-高山植物物种的主要冰川避难所。这一点得到了现有分子证据的良好支持。

Bistorta（蓼科）是一个约有40个物种的属，广泛分布于北温带至北极地区。它曾被归入Polygonum，有时作为一个独立的组。但最近的作者认为它是与Polygonum不同的属。在Bistorta内，Bistorta officinalis复合群的物种分布于欧洲、北亚和北美西北部的山地到高山草甸栖息地以及高纬度苔原。该复合群的植物是多年生草本，具短根状茎，主要为基生叶，具单生、穗状、圆柱形至卵形的花序。该复合群的界限、包含的物种数量及其与其它Bistorta的关系知之甚少。旧的植物志将B. officinalis复合群处理为一或两个物种。该复合群的北极成分被不同作者命名各异。Petrovsky（1966）将名称Polygonum ellipticum Willd. ex Spreng.应用于所有亚洲（或许包括北美）北极材料；Hultén（1968）将同一分类群处理为Polygonum bistorta L. subsp. plumosum（Small）Hultén；Freeman和Hinds（2005）为北美植物保留了名称Bistorta plumosa（Small）Greene。最近，Elven和Murray认为该复合群包含三个物种：相对独特的B. officinalis Delarbre s.s.，分布于欧洲和西亚的温带山地至高海拔地区；Bistorta elliptica（Willd. ex Spreng.）V.V.Petrovsky, D.F.Murray & Elven，分布于北极东北欧和西北亚；以及B. plumosa，分布于北极东北亚和北美西北部。Bistorta elliptica和B. plumosa存在地理重叠并可能相互渐变，特别是在东亚，其变异模式了解甚少。

本研究评估了该复合群北极种群的系统发育和地理模式，特别是东亚和北美西北部的B. plumosa。我们探索了这些植物质体间隔区DNA序列的遗传变异，重点关注两个问题：（1）B. plumosa是否是B. officinalis复合群中的一个独立分类单元？（2）B. plumosa内的遗传变异模式指示了该物种的年龄和迁移历史的哪些信息？

Materials and methods

Sampling

本研究的Bistorta样本采集自阿拉斯加、育空和俄罗斯。我们从25个种群采样了73份标本，包括55份B. plumosa样本和18份B. elliptica及B. officinalis样本。从GenBank下载了另外12份Bistorta登录号（包括外类群 taxa）的序列。本研究所有采样种群的采集地和凭证信息列于附录中。采集遵循所有适用的指南和规定。

DNA extraction and sequencing

我们从压制标本或硅胶干燥的叶片组织中提取基因组DNA，使用改良的CTAB法或DNeasy Plant Mini Kit。在初步评估了六个质体间隔区后，我们对所有样本的两个可变区域——trnH–psbA和trnS–trnG基因间间隔区——进行了测序。使用引物psbA和trnH扩增trnH–psbA间隔区，使用引物trnG2S和trnS扩增trnS–trnG间隔区。PCR在50 μL体积中进行，PCR产物使用QIAquick PCR Purification Kit纯化。使用扩增引物进行Sanger测序。大多数样本，包括所有具有独特单倍型的样本，进行了双向测序。DNA测序由Macrogen（韩国首尔）完成。

Data analysis

使用Jalview 2.11.0和Aliview 1.28对序列进行比对。两个叶绿体间隔区分开比对，然后合并成一个数据集进行分析。在所有分析中，将插入缺失（indels）视为二元字符并包括在内。

使用TCS 1.21和R包pegas的haplotype和haplonet模块进行网络分析，以评估数据集中的总体变异并确定存在的单倍型数量。每个样本的两个DNA区域在分析前进行连接，插入缺失简化为单碱基字符，缺口（gaps）作为第五个字符处理。使用MrBayes 3.2.7进行贝叶斯系统发育分析，使用GTR替代模型和伽马分布速率变异。插入缺失编码为0/1并在一个单独的数据分区中。每个分析运行200万代，每100代采样一次，燃烧期（burn-in）为25%。这些分析的数据集包括从单倍型网络识别出的每个单倍型对应的序列，以及通过BLAST搜索从GenBank检索到的12份Bistorta登录号的类似序列。检索到的GenBank登录号代表了数据集中已包含物种之外的六个物种。

使用Arlequin 3.5检查B. plumosa的单倍型多样性，包括沿经度梯度的多样性差异。将物种的采样范围划分为四个样本量大致相等的经度带（每个包含4-6个种群和12-16份样本），经度边界在-147.0°、-158.0°和-170.0°；这些带（从东到西）对应于西育空/东阿拉斯加、中阿拉斯加、西阿拉斯加和俄罗斯。计算每个带及所有种群合并的遗传多样性指数（基因多样性?；核苷酸多样性π；分子多样性theta(π)）。还使用Arlequin 3.5进行错配分析（mismatch analysis），以检查提示范围扩张事件的分子模式。

Results

Phylogenetic and network analyses

从两个质体基因间间隔区获得的DNA序列总比对长度为1225 bp，其中trnH–psbA为436 bp，trnS–trnG为789 bp。加上来自GenBank的外类群序列，比对长度为1314 bp。用于贝叶斯分析的最终比对包含92个可变字符，其中59个（37个单核苷酸多态性和32个插入缺失）是简约信息性的。

在贝叶斯系统发育分析中，我们在B. officinalis复合群内识别出两个遗传上不同的支系。我们将其中一个鉴定为B. plumosa，并通过检查我们的凭证标本予以确认。另一个包括所有被指定为B. elliptica或B. officinalis的样本，根据凭证标本或GenBank中报告的序列分类单元ID确定。这两个谱系在遗传上存在分化，并且很大程度上在地理上也有区分；所有来自北美和几乎所有来自俄罗斯远东的样本被鉴定为B. plumosa，而所有来自俄罗斯中部和欧洲的样本被鉴定为B. elliptica或B. officinalis。仅在俄罗斯远东的马加丹州北部/东萨哈地区发现了代表两个谱系的样本。

Haplotype network and geographic patterns in Bistorta plumosa

我们重点关注B. plumosa的遗传多样性模式，因为我们有其大部分分布区的样本。我们发现了显著的高水平遗传变异，在19个种群的55份样本中存在22个质体单倍型。22个单倍型中，18个（81%）为一个种群所独有。只有四个单倍型（E、H、N和U）在种群间共享，且 none of these were abundant；最常见的单倍型H仅出现在4个种群的11份样本中。大多数种群（19个中的13个）至少有一个独特单倍型，八个种群仅包含独特单倍型（部分反映了采样强度，但也反映了观察到的高遗传变异）。总体基因多样性（?）是单倍型数量和高遗传分化水平的函数，在所有种群中为0.929，总体核苷酸多样性（π）为0.0060。

我们检查了B. plumosa地理范围内的遗传差异和相似性，跨越四个指定的经度带。三个单倍型出现在两个经度带：单倍型N在俄罗斯和西阿拉斯加，单倍型H和U在东阿拉斯加和西阿拉斯加。没有单倍型出现在超过两个经度带。由于广泛分布的单倍型很少，每个经度带因此呈现出 distinct array of haplotypes。

我们发现整个地理范围内的遗传变异水平差异很小，所有区域都具有高多样性。此外，观察到的遗传分化模式没有方向性成分来暗示过去的地理区域间扩散。相似的单倍型（在单倍型网络中仅相差一步）更可能出现在地理上接近的地点，但情况并非总是如此。贝叶斯系统发育和单倍型网络的比较表明，单倍型之间的关系没有明显的方向性模式；相似的单倍型可能来自相邻或广泛分离的地点。地理上分布最广的单倍型（N）由俄罗斯和西阿拉斯加的种群共享。错配分析表明了一个主要的扩散时期，似乎发生在很久以前，可能是在末次盛冰期（LGM）之前，这一点由所有区域的高遗传多样性以及区域间单倍型组成的差异所指示。

Discussion

尽管B. officinalis复合群广泛分布于北半球的温带和北极地区，但可用的植物志对其形态变异、地理分布或包含的物种很少或没有讨论。对该类群最有用的总结由Elven、Murray和Petrovsky在《泛北极植物区系清单》中提供。仅基于形态特征，这些作者将北极成分与更温带纬度的高山植物（B. officinalis s.s.）区分开来，并将北极物种划分为B. elliptica（东北欧和西北西伯利亚）和B. plumosa（东北亚和北美西北部）。我们的发现支持对这两个北极分类单元的承认。

我们为B. officinalis复合群的北极分布范围内的两个分类单元提供了分子证据。我们的系统发育分析表明，来自俄罗斯远东的样本与来自北美西北部的B. plumosa样本包含在一个单一的谱系中。B. plumosa形成了一个 distinct clade，支持了Elven等人（2007）认为它是一个独立且 distinct species的观点。需要进一步采样以确定B. elliptica和B. plumosa在亚洲的各自范围界限。尽管Elven等人（2007）认为B. officinalis是该复合群中最独特的要素，但我们采自俄罗斯更南部和西部的标本，以及来自中国山地区的GenBank样本，形成了一个可能同时包含B. elliptica和B. officinalis的独立支系。我们的采样可能只捕获了其中之一，或者我们分析中的一些样本可能命名不正确（我们从GenBank检索到一份B. officinalis样本，它与其它外类群taxa聚在一起，而不是与剩余的B. officinalis在一起）。在将我们采样地点的凭证标本与B. elliptica和B. officinalis的可用形态描述进行比较后，我们将该支系中的大多数样本归属于B. elliptica，但显然需要进一步的工作来评估B. officinalis复合群其余部分的关系。

B. plumosa相对于其地理范围内其他已调查的北极植物物种具有高遗传多样性。使用类似方法通过可变质体区域序列数据研究的物种包括Oxyria digyna、Bistorta vivipara、Rhodiola integrifolia、Sibbaldia procumbens和Silene acaulis。所有这些物种与B. plumosa有 substantial range overlap，但它们中的大多数在其整个范围内，尤其是在白令地区，具有低得多的遗传多样性水平，特别是考虑到序列单倍型之间的分子分化。在这些研究中，只有Oxyria digyna——一个非常古老且广泛分布的北极物种，具有3 Ma的跨北半球传播历史——在白令地区具有可比的高水平质体遗传多样性。一个特别有启发性的比较是与B. vivipara进行的，后者使用与我们为B. plumosa测序相同的两个质体间隔区进行了遗传变异调查。分子多样性指数theta(π)在B. plumosa中比在B. vivipara中高约4-5倍。

上述所有物种的遗传模式在其地理范围内都有变化，并且正如预期的那样，它们在冰川避难所区域具有更高的遗传变异性。使用基于核数据的各种分子方法，在整个北极地区的其他物种中也证明了这一点。这些研究为个体物种乃至整个北极植物区系的历史中的范围变化和移动方向提供了证据。相比之下，对于B. plumosa，我们在采样范围内的所有地方都发现了相似水平的单倍型多样性，没有明显的方向性传播证据。错配分析的结果表明在遥远的过去，也许是更新世中晚期，发生过一次范围扩张事件，尽管我们无法确定该事件的时间。Mathews和Ovenden（1990）报道了来自加拿大北极的晚第三纪（新近纪）Polygonum化石，但这些未被鉴定到种，且不能提供可靠的校准。在B. plumosa中观察到的遗传模式仅基于质体数据，需要核标记的进一步证实。然而，它们表明在扩散之后，该物种在很长一段时间内保持了相对稳定的地理范围，随着时间推移局部逐渐分化。在北美，其范围在LGM期间局限于白令地区，我们的遗传证据表明，与其他两栖白令物种一样，B. plumosa在现今白令海峡两侧的种群仍然相似。该物种的范围地图和出现记录显示，其当代分布仅略微超出未冰盖白令避难所的边界。这与许多已更广泛扩散到 former glaciated terrain 的北极物种的地理分布形成对比。

我们关于B. plumosa的数据支持了正在形成的理解：即使在特定的地理区域内，北极苔原植物也远非一个同质群体。相反，物种在历史、遗传结构和转移分布的能力上差异很大，这些差异很可能反映在未来气候变化的不同响应中。

Acknowledgements

我们感谢所有协助野外工作或为本研究提供样本的人员。