靶向脑部细胞外囊泡递送siRNA抑制铜死亡治疗蛛网膜下腔出血的创新研究

本研究发现铜死亡（cuproptosis）在蛛网膜下腔出血（SAH）后神经损伤中起关键作用，通过构建靶向性RVG-RBCEVs/siRNA递送系统，特异性抑制脂酰合酶（LIAS）表达，显著减轻氧化应激（OS）和线粒体功能障碍，为SAH治疗提供了新型神经保护策略。

　　

Abstract

背景 蛛网膜下腔出血（SAH）主要由动脉瘤破裂引起，全球范围内具有高死亡率。铜死亡（cuproptosis）是一种铜诱导的细胞死亡形式，通过调控脂酰化三羧酸循环蛋白发挥作用。本研究旨在通过设计脑靶向siRNA递送系统抑制铜死亡，为SAH提供新的治疗策略。

方法 研究团队从基因表达综合数据库（GEO）获取SAH相关转录组数据，并通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）进行验证。采用狂犬病毒糖蛋白-红细胞细胞外囊泡（RVG-RBCEVs）负载LIAS siRNA，通过外周注射递送至SAH小鼠脑组织。系统评估了该递送系统对铜水平、铜死亡功能蛋白富集、谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量、线粒体呼吸功能和膜电位、透射电镜观察、神经功能评分、脑水含量、血脑屏障损伤及Fluoro-Jade C染色等方面的影响。

结果 研究发现三个铜死亡相关基因（CRGs）存在差异表达。通过生物正交点击化学反应将RVG肽与红细胞细胞外囊泡表面连接，成功构建了RVG-RBCEVs/siRNA复合体。该复合体能够被神经元特异性摄取，下调CRGs中的LIAS表达，减少活性氧（ROS）积累，抑制神经元铜死亡，并在体内发挥神经保护作用。

结论 研究表明铜死亡在SAH后神经损伤中起关键作用。神经元靶向的RVG-RBCEVs/siRNA治疗通过抑制LIAS表达来阻断铜死亡通路，从而减轻氧化应激。这种创新方法能够改善神经行为功能障碍，为SAH后神经保护提供了新策略。

Introduction

蛛网膜下腔出血是一种主要由动脉瘤破裂引起的危重疾病，随着人口老龄化，其发病率持续上升。尽管SAH的诊断和治疗取得了显著进展，但患者预后仍然较差。早期脑损伤（EBI）是SAH不良预后的关键因素，其病理生理过程包括神经炎症、氧化应激（OS）、线粒体功能障碍、脑水肿、血脑屏障（BBB）损伤和细胞死亡。

大量研究表明铜缺乏与卒中、阿尔茨海默病、门克斯病、创伤性脑损伤等神经系统疾病直接相关。由于大脑具有较高的代谢和信号传导需求，铜在其中特别丰富。铜超载会导致活性氧（ROS）过度产生，引起氧化损伤，并削弱大脑清除羟自由基的能力。另一方面，铜超载还会导致铜死亡，这一过程受到线粒体ROS的调控。

小细胞外囊泡（sEVs）源自腔内囊泡，直径小于200纳米，能够自由穿过血脑屏障。它们作为重要的细胞间通讯介质，携带来自供体细胞的多种生物分子（RNA、蛋白质、代谢物和脂质）传递给受体细胞。天然sEVs不能特异性靶向器官，先前研究证明用狂犬病毒糖蛋白（RVG）肽修饰的sEVs能够携带药物穿过血脑屏障治疗SAH。

Materials and methods

患者样本

研究纳入了46例世界神经外科联合会（WFNS）分级Ⅰ-Ⅳ级的SAH患者，在2023年10月至2024年5月期间通过腰椎穿刺、外引流或脑室引流获取脑脊液（CSF）样本。对照组纳入了10例手术前接受脊髓麻醉的腹股沟疝患者。

数据收集与CRG鉴定

从GEO数据库获取GSE79416数据集，基于先前研究确定的36个CRGs进行差异表达分析。使用ConsensusClusterPlus软件包进行统计学分析，设定调整后p值<0.001为显著差异。

sEVs的分离与表征

从芜湖市中心血站获取O型血样本，通过多步离心法分离红细胞细胞外囊泡（RBCEVs）。使用透射电镜（TEM）观察囊泡形态，Zetaview-PMX120仪器分析尺寸分布，Western blot检测标志物蛋白表达。

RVG29与RBCEVs的连接

通过无铜点击化学反应将RVG29-azide肽与DBCO修饰的RBCEVs连接，形成稳定的三唑键。使用Cy5.5荧光标记追踪连接效率，荧光显微镜观察共定位情况。

siRNA负载

采用电穿孔法将LIAS siRNA或阴性对照（NC）负载到RVG-RBCEVs中，使用NanoDrop ND-2000分光光度计检测未结合siRNA浓度，确保负载效率。

统计分析

使用Prism V.6.0和MedCalc V.19.0.4软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示，采用适当的参数或非参数检验进行组间比较，p<0.05认为具有统计学意义。

Results

SAH中CRGs的鉴定

在SAH大鼠脑样本中，36个CRGs中有14个表达上调，其中LIAS、PLAT和LIPT2三个基因的|log₂(fold-change)|>0.5且p<0.001。GO注释显示这些基因主要与线粒体能量代谢相关，包括氧化磷酸化和电子传递链组装。qRT-PCR验证了这三个mRNA在SAH小鼠模型中表达显著升高，其中LIAS表达在SAH后12-24小时达到峰值，铜水平在24小时达到峰值。

LIAS与SAH严重程度的关系

SAH患者发病后3天内CSF中LIAS和铜水平显著上调，且LIAS水平与WFNS评分呈正相关。免疫荧光染色显示Lias蛋白定位于颞叶基底下部神经元，而不在星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞中表达。

RVG-RBCEVs的制备与表征

通过两步法成功构建RVG-RBCEVs：首先将水溶性DBCO-sulfo-NHS与RBCEVs表面蛋白形成共价键，然后通过无铜点击化学反应与RVG29-Azide肽连接。TEM显示未修饰RBCEVs和RVG-RBCEVs均呈现典型囊泡形态，纳米颗粒追踪分析（NTA）显示平均直径从86纳米增大到134纳米。Western blot证实CD63、TSG101、Alix和血红蛋白A在纯化RBCEVs中表达。

RVG-RBCEVs/siRNA的特性与靶向能力

电穿孔法成功将LIAS siRNA负载到未修饰RBCEVs和RVG-RBCEVs中。近红外荧光（NIRF）成像显示，与未修饰RBCEVs和RBCEVs/siRNA相比，RVG-RBCEVs/siRNA在SAH出血区域的荧光强度显著更高，停留时间更长。器官分布分析显示RVG-RBCEVs/siRNA在大脑中特异性积累，免疫荧光染色证实其被神经元特异性摄取。

RVG-RBCEVs/siRNA在体内降低铜死亡关键因子LIAS表达

SAH后24小时，RVG-RBCEVs/siRNA治疗显著降低脑组织中LIAS蛋白和mRNA水平，铜水平也显著降低。脂酰化DLAT和DLST蛋白在SAH脑中升高，而RVG-RBCEVs/siRNA注射引起更明显的下降。

RVG-RBCEVs/siRNA调节SAH小鼠线粒体功能

SAH诱导导致颞叶基底下部GSH表达降低，而RVG-RBCEVs/siRNA治疗显著提高GSH含量。MDA作为铜死亡的主要特征，在SAH小鼠颞叶中显著上调，RVG-RBCEVs/siRNA组MDA含量显著下调。呼吸控制比（RCR）值在SAH后降低，治疗后升高。JC-1染色显示SAH后J-聚集体减少、单体增加，治疗减轻了膜电位崩溃。TEM观察显示治疗组线粒体嵴数量显著增加。

RVG-RBCEVs/siRNA治疗对SAH后神经保护的作用

改良Garcia评分（mGS）显示SAH组神经功能评分较差，治疗后得到恢复。烟囱试验（CT）和平衡木试验（BBT）显示治疗显著改善运动能力和协调性。脑水肿程度和Evan's blue渗出量在治疗组显著降低。Fluoro-Jade C（FJC）染色显示治疗组神经退行性变显著减少。

Discussion

本研究成功构建了脑靶向siRNA递送系统用于SAH治疗，证明RVG-RBCEVs/siRNA通过抑制铜死亡保护神经元。生物信息学分析发现三个CRGs在SAH中高表达，体内外实验验证了LIAS在SAH中的关键作用。

铜死亡的特点是铜与线粒体内TCA循环的脂酰化成分直接相互作用，导致脂酰化蛋白积累和Fe-S簇蛋白耗竭。本研究首次报道了铜死亡通路在SAH中的激活，LIAS蛋白作为潜在生物标志物和治疗靶点。

细胞外囊泡作为新兴药物递送载体，能够将治疗性核酸递送至大脑。与传统来源的EVs相比，RBCEVs具有获取快速、产量高、无遗传核酸干扰等独特优势。通过生物正交点击化学方法构建的RVG-RBCEVs/siRNA系统，实现了神经元特异性靶向和高效基因沉默。

LIAS作为铁硫簇蛋白，参与线粒体硫辛酸合成，在铜死亡中起关键作用。抑制LIAS表达减少了脂酰化DLAT和DLST蛋白水平，改善了线粒体氧化应激指标，最终发挥神经保护作用。

Conclusion

本研究成功构建并验证了RVG/RBCEVs脑靶向递送系统，能够有效改善线粒体氧化应激和减少SAH后铜死亡。鉴于铜死亡在SAH中的关键作用，这些结果为SAH治疗提供了基于RBCEVs的新治疗策略。