全海藻与海藻提取物对高粗饲料日粮下育成母牛瘤胃发酵、养分消化率及甲烷排放的影响研究

本研究评估了全海藻（Ascophyllum nodosum）与海藻提取物（Himanthalia elongata）对高粗饲料日粮下育成母牛瘤胃发酵、养分消化率及甲烷（CH4）排放的影响，发现二者虽未显著降低CH4排放，但H. elongata提取物可提升纤维消化率，为开发环保型饲料添加剂提供了重要参考。

　　

引言

反刍动物肠道甲烷（CH₄）排放是牛肉和乳制品产业链中最大的温室气体来源。随着全球对肉制品和乳制品需求的增长，若不采取减排措施，反刍动物数量的增加将进一步加剧CH₄排放。因此，在满足消费者对高品质、安全且经济实惠食品需求的同时，降低反刍动物的CH₄排放至关重要。目前，遗传选择、营养策略和瘤胃微生物组调控等多种方法被提议用于减少肠道CH₄排放。

近年来，海藻作为反刍动物饲料添加剂的潜力备受关注，因其可能减少肠道CH₄生成。尽管含溴仿的红藻Asparagopsis物种备受瞩目，但溴仿类化合物在减少CH₄的同时可能对动物和人类健康产生负面影响。此外，栽培限制、野生生物质采集约束、饲料法规关于入侵物种使用以及活性成分在储存期间的稳定性等问题，可能限制海藻在反刍动物日粮中的潜在应用。因此，研究开始探索除溴仿化合物以外的替代性褐藻及其生物活性物质对CH₄减排的潜力。

褐藻富含独特的脂肪酸、多酚（称为褐藻单宁）、皂苷、肽和碳水化合物，这些成分在体外实验中显示出将肠道CH₄生成降低10%–15%的潜力。海藻中的多酚可能结合部分蛋白质，增加瘤胃非降解可消化蛋白的量，从而减少CH₄排放。多酚还能通过抑制瘤胃原生动物和选择性靶向某些细菌来改变瘤胃发酵。选择性抑制原生动物被认为是减少CH₄生成的一种有前景的方法。

Ascophyllum nodosum是一种褐藻，广泛分布于加拿大太平洋海岸和欧洲北大西洋海岸。它含有多种生物活性化合物，包括具有抗氧化活性的多酚，并且富含微量及宏量矿物质。尽管A. nodosum已在体外瘤胃模拟和气体模型中进行广泛测试，但动物试验有限。据我们所知，尚未有研究探讨A. nodosum对肉牛肠道CH₄生成的影响。

Himanthalia elongata是另一种褐藻，分布于爱尔兰海岸和大西洋沿岸。它富含多种营养素，如维生素、矿物质、氨基酸、脂肪酸和膳食纤维。与其他海藻物种相比，H. elongata具有更高浓度的酚类化合物、抗氧化剂、岩藻糖（26.3 g/kg）和钾（57,480 ± 19,976 mg/kg）。此外，它还含有高浓度的褐藻单宁（321 mg/g干物质（DM）），并显示出独特的抗菌和抗氧化特性，使其适合作为改善反刍动物健康的膳食补充剂。

尽管已对这些选定海藻进行了体外评估，但评估它们对肠道CH₄生成影响的动物试验有限。因此，本实验研究了A. nodosum和H. elongata提取物对高粗饲料日粮下育成母牛瘤胃发酵、养分消化率和肠道CH₄生成的影响。

材料与方法

本研究在加拿大农业及农业食品部莱斯布里奇研发中心进行。动物护理遵循加拿大动物护理委员会的指南，研究经莱斯布里奇研发中心机构动物护理委员会审查并批准（ACC2207）。

实验设计

实验采用重复3×3拉丁方设计，使用六头安格斯杂交母牛，分为三个35天周期和三种日粮处理。每个周期包括7天的洗脱期（所有动物饲喂对照日粮），随后是14天的日粮处理适应期和14天的测量与样品收集期。两个方阵（每方阵3头母牛）错开一周进行，因为仅有三个呼吸室可用。瘤胃瘘管肉牛按体重（初始体重367.5 ± 10.7 kg）分组，并随机分配处理序列。母牛饲喂基础日粮，包含52%大麦青贮、44%大麦秸秆和4%矿物质补充剂（以DM为基础）。全海藻（A. nodosum）和海藻提取物（H. elongata）以日粮DM的2%比例补充，替代等比例的大麦青贮和大麦秸秆。此添加比例基于先前海藻在肉牛日粮中的补充研究确定。基础日粮根据NASEM（2016）配制，以满足肉牛维持营养需求，全混合日粮（TMR）和原料的化学成分见表1。TMR使用Data Ranger（美国卡兰公司）制备，母牛饲养于拴系栏舍，除呼吸室测量或消化率测量期外，每日在干燥场地运动。

全海藻与海藻提取物

A. nodosum和H. elongata于2020年11月采集自爱尔兰西北海岸，采用低温（<28°C）干燥法干燥。海藻随后研磨（1 mm），真空密封于25 kg袋中，并通过快递运输至AAFC进行动物实验。H. elongata提取物通过木聚糖酶水解生成，方法如前所述。提取物使用哈特干燥机（最高温度60°C）干燥。全海藻和提取物的蛋白质、灰分、脂质和水分含量采用AOAC方法测定。海藻和提取物的溴仿含量使用GC-MS测定，方法基于Machado等人（2016）和Krizsan等人（2022）的方法修改。海藻和提取物的总多酚含量使用Kupina等人（2018）的方法测定，并以间苯三酚当量（PGE；mg PGE/g样品）表示。

海藻的化学和元素组成见表2。元素分析由商业实验室（坎伯兰谷分析服务公司）进行。铁、锰、锌和铜采用AOAC方法985.1测定，钼分析采用480°C灰化4小时的方法，硒采用方法996.16分析。

采食量与采食速率

母牛在洗脱期和日粮适应期每日0900小时饲喂TMR至自由采食。干物质采食量（DMI）通过每日测量和记录采食量和剩料量计算。TMR、大麦青贮、大麦秸秆、海藻和混合料样品每周取样并按周期混合。在总消化道消化率或呼吸室测量日，TMR、青贮和剩料样品每日取样，并按周混合。所有饲料样品在55°C下干燥72小时以测定饲料DM。

采食速率在适应期的第1、7和14天测量，通过称重料槽计算饲喂后3、6、9、12和24小时的按鲜重计采食量。重复测量旨在评估海藻添加是否改变TMR的适口性。

瘤胃发酵与pH

瘤胃采样在测量期的第1天进行。瘤胃内容物在饲喂前及饲喂后3和6小时采集。内容物从网胃、瘤胃腹囊、尾囊和背腹囊采集，并通过聚酯单丝织物（355 μm网孔）挤压过滤。滤液的三份1 mL子样品分别用0.2 mL 25%（w/v）偏磷酸、0.2 mL 1%（v/v）硫酸（H₂SO₄）或1 mL甲基绿-福尔马林-盐水溶液保存，用于挥发性脂肪酸（VFA）、氨（NH₃）和原生动物计数分析。VFA和NH₃样品储存于-20°C直至分析。瘤胃原生动物储存于暗凉柜中，直至使用光镜和计数室（Neubauer改良亮线计数池）计数。

瘤胃pH在测量期的第7天使用内置瘤胃pH计（LRCpH数据记录器）记录72小时。pH每分钟记录一次，pH记录仪在插入瘤胃前于pH 4和7标准液中进行校准。

表观总消化道消化率与血液采样

为测定干物质（DM）、有机物（OM）、粗蛋白（CP）、中性洗涤纤维（NDF）、酸性洗涤纤维（ADF）和淀粉的表观总消化道消化率，母牛在测量期的第4天起置于收集栏中三个24小时周期。每日收集每头母牛的全部粪便，称重后取1%样品储存于-20°C直至分析。

为收集全部尿液，将内置球囊导管（26 French，75-cc球囊）插入每头母牛的膀胱。尿液收集于预装500 mL 4 N H₂SO₄的封闭20 L收集容器中，以防止NH₃挥发。每日测量尿液体积，取2%酸化尿样子样品按1:5稀释后储存于-20°C直至分析。

呼吸室测量

肠道CH₄排放通过将母牛饲养于三个独立开放电路量热呼吸室（4.4 m宽×3.7 m深×3. m高）中测量。每期的第12天，母牛在呼吸室中饲养三个24小时周期，呼吸室每日开启一次以投喂饲料和清洁。每日记录饲料和饮水摄入量。方法学和排放计算的详细描述由Beauchemin和McGinn（2006）提供。呼吸室在试验前后通过依次向每个呼吸室释放已知量的CH₄和CO₂进行校准，使用质量流量计。生成每种气体的最佳拟合校准回归方程，斜率用于校正。

气体浓度使用红外气体分析仪每日校准，分析CH₄（Ultramat 5E—西门子公司）和CO₂/H₂（LI-7000—LICOR环境公司）。每个呼吸室的进气和排气空气样品依次分析约3分钟（总计6分钟/呼吸室）。所有呼吸室在27分钟内采样，额外3分钟用于测量N₂零参考气体。气体采样程序每30分钟重复一次，每24小时周期每个呼吸室总计48次。

化学分析

TMR、剩料和粪便样品的周期和母牛复合样品解冻后，在55°C强制通风烘箱中测定DM。干燥样品在Wiley磨（托马斯科学公司）中通过4 mm直径筛网研磨，再通过1 mm筛网。为将化学结果校正至DM基础，分析DM通过称取0.5 g样品于坩埚中，在135°C强制通风烘箱中放置2小时测定，并热重。同一样品随后在550°C马弗炉中燃烧5小时以测定OM和灰分含量。NDF和ADF浓度使用ANKOM A200纤维分析仪顺序测定，使用耐热α淀粉酶和亚硫酸钠用于NDF分析，结果以无残留灰分表示。子样品使用球磨机进一步研磨，用于氮和淀粉分析。CP浓度通过闪烧气相色谱分离和热导检测测定，CP计算为N×6.25。淀粉通过使用淀粉葡萄糖苷酶和1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶混合物水解α-葡萄糖聚合物测定。葡萄糖样品吸光度在490 nm波长下于微孔板读数仪读取。样品的总能量（GE）含量使用弹式量热仪测定。

瘤胃VFA通过气相色谱（型号5890；惠普公司）定量，使用毛细管柱和火焰离子化检测。NH₃浓度通过水杨酸盐-硝普钠-次氯酸盐方法使用流动注射分析仪测定。

统计分析

自由采食量计算为适应期第7天至第14天的平均采食量。对于瘤胃pH，原始mV记录使用插入瘤胃前后校准的线性回归转换为pH。mV到pH的转换用于线性说明pH传感器随时间的漂移。数据总结为24小时周期，报告pH的最小值、平均值、最大值和标准差。表观总消化道消化率计算为饲料与对应粪便中养分成分的差异。每日CH₄计算如前所述，报告为CH₄产量（g/天）、排放系数（g/kg DMI）以及占GE摄入量（GEI）的比例（Ym），假设CH₄的能量含量为13.3 Mcal/kg。

使用SAS的UNIVARIATE程序检验正态分布。数据使用MIXED MODEL程序分析，模型包括处理的固定效应，以及方阵、方阵内动物和方阵内周期的随机效应。日或小时作为采食行为、瘤胃pH和呼吸室测量的重复测量。使用Akaike信息准则的最小值选择协方差结构。使用Tukey检验计算错误发现率校正p值，当p < 0.05时声明均值差异。

结果

A. nodosum的蛋白质、灰分和脂质含量分别为7.23%、19.33%和3.59%。其间苯三酚含量为10.71 mg PGE/g样品。H. elongata提取物的蛋白质、灰分和脂质含量分别为8.70%、25.2%和1.33%。其多酚含量为0.43 mg PGE/g样品。两个样品中均未检测到溴仿浓度。

自由采食DMI不受处理影响。处理与日在6小时采食量上存在交互作用，其中H. elongata在第14天的采食量低于对照日粮在第1天的采食量。12小时采食量H. elongata高于对照和A. nodosum，但这未影响该小时的采食比例。

瘤胃NH₃、VFA或pH无处理×小时交互作用，因此数据仅按处理呈现。处理对NH₃产量、总VFA或瘤胃pH无影响。仅丙酸比例H. elongata低于对照和A. nodosum，其他VFA无影响。

DM、OM、CP、能量和淀粉的表观总消化道消化率不受处理影响。H. elongata对NDF和ADF消化率有影响，消化率分别比对照提高11.5%和13.3%。

呼吸室测量期间DMI和体重处理间无差异。A. nodosum或H. elongata对CH₄产量或排放系数无影响；然而，CH₄能量及CH₄占能量摄入比例H. elongata高于对照。

讨论

减少反刍动物肠道CH₄排放因其对环境的影響和其在气候变化中的作用已成为优先事项。多项研究探讨了海洋海藻在体外和泌乳牛中的抗产甲烷潜力，但据我们所知，尚无研究聚焦A. nodosum和H. elongata提取物对育成母牛肠道CH₄生成的影响。因此，本研究首次探讨了A. nodosum和H. elongata提取物对高粗饲料日粮下育成母牛瘤胃发酵、养分消化率和肠道CH₄生成的影响。

本研究中H. elongata和A. nodosum的化学组成相似；然而，A. nodosum的NDF含量（38.3%）高于H. elongata（15.9%），且H. elongata的多酚含量因提取过程降低（7.46 vs. 0.43 mg PGE/g）。此外，A. nodosum的灰分含量（19.33%）低于H. elongata提取物（25.18%），水解使H. elongata的灰分含量从19.20%增加至25.18%。相反，A. nodosum的铁（591.4 vs. 146.0 ppm）、锰（140.4 vs. 67.7 ppm）、锌（40.2 vs. 14.3 ppm）和碘（178.98 vs. 55.66 ppm）浓度高于H. elongata提取物。海藻可积累大量重金属、碘和其他矿物质，当纳入反刍动物日粮时可能对动物健康产生负面影响。本试验中两种海藻的重金属浓度在以日粮DM的2%饲喂时未超过加拿大食品检验局规定的总日粮允许浓度；然而，评估海藻作为反刍动物饲料的功效时，必须考虑重金属和碘的浓度。本研究中海藻对DMI无影响表明，测试的2%添加比例对母牛可接受且适口。

在反刍动物日粮中补充褐藻可通过增强VFA生产改善瘤胃发酵。丙酸是瘤胃中合成的主要VFA，是反刍动物的主要能源。瘤胃中丙酸比例增加与产甲烷作用减少相关，因为氢从产甲烷作用重新导向丙酸生成。本研究表明，H. elongata提取物降低了丙酸比例 compared to对照和A. nodosum处理；然而，对肠道CH₄排放无影响。与本研究相反，Thorsteinsson等人（2023）观察到饲喂A. nodosum的奶牛丙酸比例低于饲喂Sargassum muticum和青贮Saccharina latissimi的奶牛。作者表明，A. nodosum组瘤胃淀粉消化率降低可能是丙酸比例较低的原因；然而，本研究中A. nodosum和H. elongata均未影响淀粉消化率。

与Roskam等人（2022）一致，添加A. nodosum和H. elongata提取物未改变NH₃产量、总VFA或瘤胃pH。七种褐藻和绿藻物种（包括A. nodosum、H. elongata、Bifurcaria bifurcata、Cystoseira tamariscifolia、Fucus vesiculosus、Pomacea canaliculata和Ulva intestinalis）的体外评估发现，相对于对照，每日总VFA产量、乙酸或丙酸产量无影响。相反，Künzel等人（2022）报告，在TMR中添加5% A. nodosum降低了体外VFA和NH₃产量，表明发酵抑制。各种大型藻类物种间VFA产量的差异可能与其营养价值、添加水平和瘤胃内降解难易度相关。这表明化学组成和生物活性物质的差异可改变发酵特性。A. nodosum的发酵减少表明，与此TMR相比，该海藻的低营养和能量浓度可能对动物性能产生不利影响当补充到日粮中时。

本研究中A. nodosum和H. elongata未影响DM、OM或CP的表观总消化道消化率，这与Antaya等人（2019）的发现相似。Antaya等人（2019）观察到，接收113 g/天干燥研磨A. nodosum的泌乳奶牛在饲喂部分TMR时未影响DM、OM、NDF和总OM及CP摄入量的表观总消化道消化率。相反，本研究中H. elongata提高了NDF和ADF消化率 compared to对照日粮。由于VFA未增加，这表明海藻未改善日粮消化率，而是H. elongata可能比TMR更快速地在瘤胃中降解。

含褐藻单宁的褐藻有潜力减少反刍动物的CH₄生成。褐藻单宁可通过结合微生物细胞壁上的蛋白质直接抑制产甲烷菌，或通过结合饲料蛋白质间接降低其在瘤胃中的消化率。本研究表明，添加A. nodosum或H. elongata未影响CH₄产量、排放系数或强度，尽管它们富含褐藻单宁。相反，H. elongata实际上增加了CH₄占GEI的百分比，尽管这可能是先前讨论的NDF和ADF消化率提高的结果。在一项荟萃分析中，Sofyan等人（2022）报告，褐藻包括Laminaria ochroleuca、Ecklonia stolonifera、Undaria pinnatifida、Eisenia bicyclis、Sargassum fusiforme和Sargassum fulvellum未改变体外CH₄产量。Antaya等人（2019）未观察到干燥A. nodosum对CH₄排放系数或强度有任何影响；然而，作者观察到日粮×周期对肠道CH₄产量的交互作用，其中A. nodosum饲喂的奶牛在实验的第一个周期CH₄产量降低，但在随后的两个周期中未降低。Thorsteinsson等人（2023）发现，4% A. nodosum未影响奶牛的CH₄排放系数和强度，尽管海藻采集发生在8月至9月，据报告此期间海藻具有更高多酚和更低灰分含量。相反，Künzel等人（2022）发现，添加5% A. nodosum降低了每克OM降解产生的CH₄毫升数；然而，体外气体产量也降低，可能 due to A. nodosum的高碘含量（35 mg/kg DM）。A. nodosum在减少牛CH₄排放方面的有效性似乎多变，可能取决于添加水平、补充持续时间