利用植物提取物作为底物在非洲爪蟾卵母细胞中进行非靶向转运蛋白底物鉴定的方法开发与评估

本综述系统开发并评估了四种拟南芥幼苗提取方案，旨在创建代谢多样性高、低毒性的植物提取物，用于非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中植物转运蛋白的高通量功能筛选（transportomics）。研究通过生物（flg22、几丁质）与非生物（氮磷饥饿）胁迫处理扩大代谢空间，结合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）与分子网络分析，成功鉴定200余种代谢物，为植物转运蛋白功能解析提供了关键技术支持。

　　

引言

膜转运代谢物的能力对所有生命维持细胞稳态和实现信号传导至关重要。然而，在构成当代基因组约10%编码序列的数千种转运蛋白中，大多数仍未有明确功能归属。为填补这一知识空白，需要有效的实验方法为转运蛋白分配底物。过去二十年间，异源表达转运蛋白于模式生物、暴露于代谢物提取物作为复杂底物混合物，以及通过非靶向液相色谱-质谱（LC-MS）检测转运活性，已成为一种称为transportomics的工具，用于非靶向鉴定人类和植物转运蛋白底物。

材料与方法

植物材料灭菌与生长

野生型拟南芥（Arabidopsis thaliana）生态型哥伦比亚0（Col-0）种子用于无处理及生物和非生物胁迫下的植物生长。种子用含0.01% Triton X-100的70%乙醇灭菌10分钟，清洗后干燥，加水于4°C分层4天。种子在无菌液体Murashige-Skoog（MS）培养基中生长，恒定光照（120 μE）和温度（21°C），摇床速度逐渐增加。7天后添加新鲜MS培养基，14天更换培养基进行营养缺乏处理。胁迫处理包括：无处理MS培养基、无机氮饥饿（-N）、无机磷饥饿（-P）、flagellin 22（1 μM flg22）和几丁质（0.1 mg/ml）处理，持续2天。处理后植株清洗、 blot干燥并速冻于液氮，储存于-80°C直至冻干。

植物材料制备与实验设计

冻干与粉碎

冻干幼苗在LyoCube台式冻干机上干燥48小时，粉碎成细粉。

实验设计

两个独立植物批次平行生长，每批次包括8瓶未处理植物和8瓶各处理植物，共40瓶/批次。不同瓶植物材料视为生物学重复。提取方案比较中，未处理植物的冻干材料混合成均质粉末，等分生成技术重复用于提取方案比较。

代谢物提取方案

所有溶剂（乙腈、甲醇、乙醇、二氯甲烷）购自Merck。四种提取方案平行进行，各方案在未处理植物材料上执行5个技术重复。

提取方案A

冻干植物材料（100 mg）于干冰中称重，加1.5 ml乙腈/甲醇（1:1）含3 μM内标氨苄青霉素，涡旋30秒，水浴超声20分钟，离心后取上清。重复提取两次，合并上清，过滤后氮气干燥。

提取方案B

类似方案A，使用乙醇/甲醇（1:1）作为溶剂。

提取方案C

使用甲醇/水（8:2）作为溶剂，相同步骤提取三次。

提取方案D

二氯甲烷/甲醇（3:1）提取，水诱导相分离，取上清相（甲醇-水），干燥储存。

毒性测定

卵母细胞注射无核酸酶水，在植物提取物重悬的Kulori缓冲液（pH 5，含5%乙醇和100 μg/mL阿米卡星）中孵育1小时，清洗后匀浆， targeted分析 glucosinolate。

胁迫处理对代谢组的影响

使用选定提取方案（方案D）处理对照和处理冻干植物材料，生成提取物并合并为 pooled extract。

液相色谱-质谱分析

提取方案比较

UHPLC-TOF-MS分析，正负离子模式，质量范围m/z 50-1200。

毒性/渗透测定靶向分析

LC-QQQ-MS，多反应监测（MRM）模式。

Pooled提取物代谢分析

LC-QTOF-MS分析，正负离子模式，MS/MS数据采集。

MSDIAL预处理

数据导入MSDIAL 4.0进行峰提取、反卷积、峰对齐和峰鉴定，使用MS-CleanR过滤非信息性代谢特征。

统计分