揭示骨肉瘤细胞mtRNA阳性与阴性间的差异基因表达：线粒体功能之外的深远意义

本研究通过生物信息学分析，揭示了骨肉瘤细胞中线粒体RNA（mtRNA）状态差异导致的104个差异表达基因（DEGs），并鉴定出COL1A1、PDGFRB和SPARC三个核心枢纽基因。这些基因与细胞外基质（ECM）重构、胶原形成及线粒体功能密切相关，为理解mtRNA驱动的骨肉瘤发生机制提供了新视角，并提示其作为潜在治疗靶点的价值。

　　

背景

骨肉瘤是一种起源于原始间充质细胞的恶性骨肿瘤，多见于青少年和年轻成人，发病率在0–24岁人群中达到每年每百万约4.4例。尽管在病理生理学、肿瘤免疫学和遗传学等多个领域已取得显著进展，但过去几十年中，骨肉瘤患者的长期临床结局并未得到显著改善。因此，寻找新的分子靶点以抑制骨肉瘤细胞生长成为亟待解决的问题。

在线粒体功能方面，线粒体RNA（mtRNA）编码氧化磷酸化（OXPHOS）系统中的13种必需蛋白，以及22种线粒体tRNA（mt-tRNA）和2种线粒体rRNA（mt-rRNA）。mtRNA处理或降解的破坏，例如RNase介导的多顺反子转录本切割失败或异常RNA清除障碍，可在多个层面损害线粒体功能。处理不良或不稳定的mt-mRNA和mt-tRNA会损害13种线粒体编码的OXPHOS亚基（ND1-6、COXI-III、ATP6/8和CYB）的翻译，降低其水平，并阻止复合物I–V（特别是I、IV和V）的正确组装。这种破坏会导致质子梯度崩溃，急剧减少ATP合成，并迫使细胞上调糖酵解和替代底物水平磷酸化。在骨肉瘤等癌症中，这种代谢转变支持缺氧下的增殖，同时增加活性氧（ROS）、DNA损伤和生存信号。尽管类似的mtRNA驱动致癌机制已在肺癌和乳腺癌中得到记录，但它们对骨肉瘤中OXPHOS完整性、ATP产生和肿瘤细胞存活的具体影响仍有待阐明。

材料与方法

数据来源于GEO数据库中的GSE73120数据集，该数据集包含来自含有线粒体DNA（mtDNA）的143B骨肉瘤细胞及其缺乏mtDNA的rho-zero对应物的基因表达谱。数据使用GPL10558 Illumina HumanHT-12 V4.0表达芯片生成，实现了跨两种肿瘤类型的全基因组转录组分析。

差异表达分析使用GEO2R进行，该网络工具应用limma和GEOquery R包比较mtDNA充足（OM）和mtDNA缺乏（WOM）的143B骨肉瘤组之间的基因表达。调整后p值<0.05且|log2倍数变化（FC）|>1的基因被视为显著差异表达。

富集分析使用Metascape和WebGestalt进行，这些工具整合了Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）通路数据库。富集分析结果的可视化使用Xiantao网站完成。调整后p值<0.05被认为显著。

蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络使用STRING数据库构建，并使用Cytoscape v.3.7.1软件进行可视化。组合得分>0.4是识别显著PPI的标准。枢纽基因使用CytoHubba插件的MCC算法识别，网络模块使用MCODE提取。

枢纽基因在肉瘤中的表达使用GEPIA数据库进行验证，该数据库整合了The Cancer Genome Atlas（TCGA）和Genotype-Tissue Expression（GTEx）数据。我们比较了肉瘤（SARC）与匹配正常组织之间的表达水平，评估了总生存关联，并使用Spearman分析检查了基因间相关性。

所有统计评估均使用R（版本4.1.0）进行。GEO2R和富集工具应用了内置校正（Benjamini–Hochberg FDR）。Spearman等级相关用于基因共表达分析。双尾p值<0.05在整个过程中被认为具有统计学意义。

结果

差异表达基因的鉴定

通过GEO2R分析GSE73120，经过标准标准化，鉴定出104个DEGs，包括89个上调基因和15个下调基因。火山图和热图显示了基于线粒体基因表达模式的mtRNA充足和mtRNA缺乏样本之间的清晰分离。

功能富集分析

将线粒体相关DEGs上传至Xiantao网页和Metascape后，富集分析结果表明这些DEGs参与细胞外基质结构组成、肝星状细胞活化调节、生物调节、膜和蛋白结合。值得注意的是，基因集富集分析一致识别出与细胞外基质和胶原形成相关的术语。

PPI网络分析

使用STRING和Cytoscape构建的PPI网络揭示了一个密集互连的模块，其中CytoHubba的MCC算法将COL5A1、ITGA1、PDGFRB、SPARC、COL1A1、ITGA11、LAMA4、ACTA2、COL5A2和MMP9排名为顶级枢纽基因。进一步的MCODE聚类确认COL5A1、ITGA1、PDGFRB、SPARC、COL1A1、LAMA4和MMP9是一个核心线粒体细胞外基质相关模块的成员。维恩图说明了这些候选枢纽基因之间的重叠。

枢纽基因在肉瘤中的表达验证

使用GEPIA数据库提取和分析肉瘤的基因表达数据。通过此分析，COL1A1、PDGFRB和SPARC被识别为肉瘤相关基因。具体而言，COL1A1在13种肿瘤类型中高表达，包括乳腺浸润癌（BRCA）、弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBC）、食管癌（ESCA）、胶质母细胞瘤（GBM）、头颈鳞状细胞癌（HNSC）、肾嫌色细胞癌（KICH）、肝细胞癌（LIHC）、肺腺癌（LUAD）、肺鳞状细胞癌（LUSC）、胰腺腺癌（PAAD）、胃腺癌（STAD）、甲状腺癌（THCA）和胸腺瘤（THYM）。相反，COL1A1在宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌（CESC）以及子宫体子宫内膜癌（UCEC）中低表达。

PDGFRB在6种肿瘤细胞系中高表达，包括DLBC、HNSC、LIHC、PAAD、STAD和THYM，在12种肿瘤细胞系中低表达，包括肾上腺皮质癌（ACC）、膀胱尿路上皮癌（BLCA）、KICH、肾乳头状细胞癌（KIRP）、LUAD、LUSC、卵巢浆液性囊腺癌（OV）、前列腺腺癌（PRAD）、皮肤 cutaneous黑色素瘤（SKCM）、THCA、UCEC和子宫癌肉瘤（UCS）。

SPARC在15种肿瘤细胞系中高表达，如ACC、BRCA、结肠腺癌（COAD）、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、肾透明细胞癌（KIRC）、脑低级胶质瘤（LGG）、LIHC、PAAD、直肠腺癌（READ）、SKCM、STAD和THYM，在UCEC中低表达。此外，COL1A1、PDGFRB和SPARC之间的相关性分析揭示了显著的相互关系。然而，生存分析表明这些基因的表达水平对肉瘤患者的总生存（OS）没有显著影响。而且，配对肿瘤和正常组织样本的分析显示COL1A1、PDGFRB和SPARC没有显著差异表达。

讨论

线粒体是细胞的动力源，通过氧化磷酸化（OXPHOS）产生ATP，关键依赖于线粒体RNA（mtRNA）表达OXPHOS组件。值得注意的是，骨肉瘤的特征是OXPHOS和ATP产生增加，这与细胞迁移和侵袭表型增加相关。Han等人报道，线粒体RNA聚合酶（POLRMT）对mtRNA转录至关重要，在骨肉瘤中显著上调，其抑制损害mtRNA合成、线粒体功能和肿瘤生长。为了进一步研究mtRNA在骨肉瘤中的作用，我们分析了线粒体相关数据集GSE73120，旨在阐明mtRNA丰度如何影响线粒体动力学和肿瘤进展。

GSE73120数据集的分析鉴定出104个差异表达基因，包括89个上调和15个下调转录本。GO和KEGG分析显示，线粒体相关DEGs在生物过程和细胞组件如结缔组织发育、胶原三聚体和细胞外基质（ECM）结构成分中富集。随后的PPI网络使用MCC和MCODE算法分析，突出COL5A1、ITGA1、PDGFRB、SPARC、COL1A1、LAMA4和MMP9作为中心枢纽基因。我们通过GEPIA数据库进一步验证了这些候选基因，缩小到COL1A1、PDGFRB和SPARC作为与骨肉瘤进展最显著相关的基因。这些数据支持COL1A1、PDGFRB和SPARC参与mtRNA驱动的骨肉瘤肿瘤发生。

COL1A1编码I型胶原的pro-alpha1链，这是一种在骨、角膜、真皮和肌腱中丰富的原纤维形成胶原，也与线粒体稳态相关。在非癌症模型中，COL1A1敲低增加活性氧（ROS）并破坏线粒体膜电位（ΔΨm）。这一发现表明，降低的COL1A1表达可能加剧由mtRNA耗竭引发的线粒体应激，在骨肉瘤细胞中造成氧化损伤和能量失衡的恶性循环。基于这种线粒体功能障碍的概念，PDGFRB作为代谢适应的关键介质出现。PDGFRB编码一种细胞表面酪氨酸激酶受体，在骨肉瘤HOS细胞中，通过PI3K/AKT/mTOR/c-Myc途径驱动有氧糖酵解，同时保留ΔΨm。因此，当143B细胞中mtRNA耗竭时，减少的PDGFRB表达不仅损害这种糖酵解转变，而且使细胞无法补偿减少的氧化磷酸化。此外，线粒体功能障碍本身可能通过减少mTOR/Akt信号反馈抑制PDGFRB转录，强化能量应激并抑制缺氧条件下的增殖。

扩展到细胞内代谢之外，SPARC作为线粒体健康与ECM动力学之间的桥梁。SPARC是一种半胱氨酸富含的酸性基质相关糖蛋白，在C2C12成肌细胞中，通过ILK/AMPK途径上调线粒体蛋白UQCRC2和SDHB，并参与应激下的线粒体未折叠蛋白反应。在mtRNA缺乏的143B肿瘤中，减少的SPARC表达可能因此破坏ECM-线粒体串扰，削弱质量控制机制，并通过改变的基质重塑促进侵袭行为。这些观察支持一个整合模型：mtRNA丢失破坏线粒体蛋白合成和功能，这又通过 distinct但互连的途径抑制COL1A1、PDGFRB和SPARC。COL1A1的下调放大ROS和ΔΨm崩溃，减少的PDGFRB限制糖酵解补偿，减少的SPARC破坏ECM-线粒体信号。 collectively，这个网络驱动氧化应激、代谢失衡和基质重塑，促进线粒体应激条件下的骨肉瘤进展。

局限性

本研究存在局限性。首先，GO和KEGG等通路富集分析虽然信息丰富，但由于 underlying方法假设和基因相关性，可能产生假阴性或有偏结果。因此，一些与我们鉴定的DEGs相邻的线粒体相关位点可能被 overlooked。其次，GSE73120数据集的样本量（143B mtDNA充足和rho肿瘤）有限，降低了统计功效和普遍性。最后，尽管我们鉴定出COL1A1、PDGFRB和SPARC作为mtRNA驱动肿瘤发生的潜在介质，实验验证仍然 essential。功能研究，如功能丧失和获得 assay、代谢和ROS测量、以及体内异种移植，将对建立因果联系和评估治疗潜力至关重要。

结论

我们对GSE73120的分析揭示了104个在细胞外基质相关通路中富集的DEGs， notably结缔组织发育和胶原三聚体形成。网络分析和GEPIA验证突出COL1A1、PDGFRB和SPARC作为与mtRNA依赖性肿瘤发生相关的中心枢纽基因。我们提出一个模型，其中mtRNA耗竭触发线粒体功能障碍，导致这三个基因的抑制、ROS积累、能量失衡和ECM重塑，从而促进骨肉瘤进展。这些见解为未来功能研究和mtRNA相关骨肉瘤的潜在治疗靶向奠定了基础。