亚慢性压力对雄性和雌性小鼠行为与表观遗传效应的性别差异性研究

本研究发现，亚慢性压力（5DVS）对雄性和雌性C57BL/6小鼠的行为和表观遗传学影响存在部分差异。通过行为测试（如LDE、EPM、OFT、FST和ERC）和DNA甲基化分析（使用甲基化特异性PCR和全局甲基化ELISA），研究揭示了压力导致的性别特异性行为变化和NAc、Hip中多个基因（如NEMO、IKKβ、PDYN、DRD2）的甲基化改变。这些发现强调了在应激相关精神疾病研究中考虑性别作为生物学变量的重要性，为开发性别特异性治疗策略提供了新的分子依据。

　　

1 引言

应激相关精神疾病，如重度抑郁症、焦虑症和创伤后应激障碍（PTSD），给社会带来沉重疾病负担，且治疗难度大。这些疾病表现出显著的性别差异，但其神经生物学基础尚不明确。通过动物模型研究应激对雄性和雌性个体的神经生物学影响，有助于揭示潜在的生物学机制，并为开发针对性别特异性的干预措施提供依据。已有研究表明，六天亚慢性可变应激（SCVS）可诱导雌性小鼠出现行为功能障碍，而雄性则表现出抵抗性，提示亚慢性应激模型可用于探究应激反应的性别差异机制。DNA甲基化等表观遗传修饰在应激反应中扮演重要角色，尤其是DNA甲基转移酶3a（Dnmt3a）的表达变化可能与性别特异性应激易感性相关。本研究采用五天可变应激（5DVS）模型，结合多种行为学测试和表观遗传学分析，旨在系统比较应激对雄性和雌性小鼠行为及DNA甲基化的影响。

2 材料与方法

2.1 动物

实验使用72只雄性和67只雌性C57BL/6小鼠，在Villanova大学内部繁殖。动物饲养于温湿度可控的房间，12小时光暗循环，分组饲养（ERC测试除外）。所有小鼠在实验开始时年龄为8-12周。行为学测试分为快速行为测试和家庭笼努力相关选择（ERC）测试，表观遗传学分析另设独立队列。

2.2 五天可变应激协议

5DVS协议包括5天每天1小时的应激暴露：第1和4天束缚应激，第2和5天狐狸尿液气味暴露，第3天悬尾应激。对照组小鼠仅进行短暂操作以控制人为处理的影响。

2.3 行为学测试

行为测试从应激结束24小时后开始，依次进行光暗 emergence（LDE）、高架十字迷宫（EPM）、旷场测试（OFT）和强迫游泳测试（FST）。家庭笼ERC测试在应激前3天开始，持续至应激后2天，共10天。ERC测试中，小鼠可自由选择跑步轮（高努力奖励）和糖精溶液（低努力奖励），记录每天跑步转数和液体消耗量。

2.4 表观遗传学分析

小鼠在应激结束2小时或1周后处死，提取NAc和Hip基因组DNA。使用甲基化特异性PCR分析特定基因位点（NEMO、IKKβ、PDYN、DRD2的编码区和启动子区）的甲基化水平，并通过ELISA试剂盒检测全局DNA甲基化（5-mC）。数据分析采用双因素ANOVA，考察性别和应激的主效应及交互作用。

3 结果

3.1 行为学结果

3.1.1 光暗 emergence测试

应激显著减少小鼠进入明室的次数、在明室停留时间和运动距离（p < 0.05），且这些效应在雌性中更为显著（应激×性别交互作用p < 0.05）。明室进入潜伏期无显著变化。

3.1.2 高架十字迷宫

EPM测试中，未观察到应激或性别对总运动距离、开臂运动距离、开臂停留时间及进入潜伏期的显著影响。

3.1.3 旷场测试

应激显著减少中心区进入次数（p = 0.035），但对总运动距离、中心停留时间和中心运动距离无显著影响。无性别差异或交互作用。

3.1.4 强迫游泳测试

雌性小鼠不动时间显著短于雄性（p = 0.009），不动次数也更少（p = 0.026）。应激对FST指标无显著影响。

3.1.5 努力相关选择行为

ERC测试中，随时间推移，小鼠跑步行为增加（p < 0.001）。应激组跑步行为显著少于对照组（p = 0.017），且雌性跑步增加多于雄性（p = 0.014）。在应激暴露期间，雌性对糖精的偏好高于雄性（p = 0.021）。糖精总消耗量雌性高于雄性（p = 0.002），应激无显著影响。

3.2 分子结果

3.2.1 甲基化分析

在NAc中，应激后2小时，PDYN编码区甲基化降低（p = 0.021），DRD2启动子区甲基化增加（p < 0.001）。IKKβ编码区存在应激×性别交互作用（p = 0.028），应激使雌性甲基化增加趋势（p = 0.062），雄性略有降低。NEMO启动子甲基化雌性高于雄性（p < 0.001）。1周后，应激降低全局甲基化（p = 0.002），PDYN编码区甲基化在雌性中应激增加（p = 0.01），且存在交互作用（p = 0.035）。在Hip中，应激后2小时，IKKβ（p = 0.020）和PDYN（p = 0.035）编码区甲基化增加，NEMO启动子甲基化雌性高于雄性（p < 0.001）。1周后，应激降低NEMO编码区（p < 0.001）和DRD2启动子甲基化（p < 0.001）。全局甲基化在Hip中无显著变化。

4 讨论

本研究显示，5DVS应激对雌性小鼠行为影响更显著，尤其在LDE测试中。ERC测试提示应激减少跑步行为，且雌性对糖精偏好更高。表观遗传学分析发现，应激对NAc和Hip多个基因甲基化的影响具有时间特异性和脑区特异性，部分基因（如IKKβ、PDYN）存在性别差异。NEMO启动子甲基化的性别差异可能与其X染色体定位相关。这些发现强调了在应激研究中考虑性别因素的重要性，并为理解性别特异性应激反应的分子机制提供了依据。未来研究需进一步探讨这些表观遗传变化与行为表现之间的因果关系，以及它们在应激相关精神疾病中的治疗意义。