生物合成聚磷酸盐增强人牙周膜干细胞成骨分化并促进小鼠牙周骨缺损再生的研究

本研究开发了一种环保的生物合成策略，利用基因工程菌从废水中生产高纯度聚磷酸盐（Bio-Poly P），证实其可安全、有效地促进人牙周膜干细胞（hPDLSCs）的成骨分化（上调RUNX2、OCN、OPN、COL1A1表达，增强ALP活性和钙沉积），并在小鼠牙周骨缺损模型中显著提升骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和小梁厚度（Tb.Th），再生效果与临床常用材料Bio-Oss?相当，为牙周再生治疗提供了新型低成本、可持续的生物材料选择。

　　

1 引言

无机聚磷酸盐（Poly(P)）是由正磷酸盐组成的线性聚合物，广泛存在于哺乳动物的细胞核、线粒体、溶酶体和质膜中。它在骨形成中发挥关键作用，通过调节钙化与脱钙过程、促进成骨细胞增殖、影响成骨基因表达以及抑制牙本质吸收参与矿物代谢。此外，Poly(P)还能稳定纤维母细胞生长因子（FGF），后者是骨基质矿化的关键调节因子。在牙周研究中，局部应用Poly(P)可诱导结缔组织重塑、改善牙龈炎症，并刺激牙槽骨再生，展现出在牙周组织工程中的治疗潜力。

然而，Poly(P)的临床应用受限于传统化学合成法的高成本、严苛反应条件及环境污染问题。近期研究开发出利用基因工程菌过表达多聚磷酸盐激酶（PPK1）的生物合成方法，能够以废水为磷酸盐来源高效、环保地生产高纯度Poly(P)（称为Bio-Poly P）。本研究通过该生物合成策略获得Bio-Poly P，并探究其对牙周韧带干细胞（hPDLSCs）成骨分化及小鼠牙周骨缺损再生能力的影响。

2 材料与方法

2.1 Bio-Poly P的合成与表征

Bio-Poly P由工程菌株通过中拷贝质粒过表达PPK1，在营养缺陷型合成废水中培养产生。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）检测O–P–O和P=O特征键，粉末X射线衍射（PXRD）分析结晶结构，扫描电镜（SEM）观察表面形态，31P核磁共振（NMR）和尿素-PAGE测定链长及分布。

2.2 细胞培养与鉴定

人牙周膜干细胞（hPDLSCs）从健康个体正畸拔除的前磨牙牙周韧带中分离，使用含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的DMEM培养基培养。流式细胞术检测细胞表面标志物（CD44、CD146阳性，CD34、CD45阴性），证实其干细胞特性。

2.3 细胞增殖与成骨分化检测

使用CCK-8法分析不同浓度Bio-Poly P（0.25–20 mg/mL）对hPDLSCs增殖的影响。通过qRT-PCR检测成骨标志基因（RUNX2、OCN、OPN、COL1A1）表达，碱性磷酸酶（ALP）活性测定及染色、阿尔新红（ARS）染色评估矿化结节形成，分别在培养第7、14和18天进行。

2.4 动物实验与微CT分析

建立小鼠牙周骨缺损模型（缺损尺寸：2×1.5×1 mm），分为空白对照组、缺损未处理组、Bio-Poly P处理组和Bio-Oss?阳性对照组。植入4周后取材，通过微CT扫描量化骨矿物密度（BMD）、骨体积/组织体积（BV/TV）、骨表面积/组织体积（BS/TV）、小梁厚度（Tb.Th）、小梁数量（Tb.N）及小梁分离度（Tb.Sp），并进行H&E染色组织学分析。

3 结果

3.1 Bio-Poly P的特性

Bio-Poly P为无色透明物质，SEM显示其呈不规则、延展编织形态；FTIR证实存在733–1235 cm?1范围内的O–P–O和P=O吸收带；PXRD显示为非晶态结构；31P-NMR和尿素-PAGE表明其平均链长约40个磷酸残基，属中链Poly(P)。

3.2 Bio-Poly P对hPDLSCs增殖的影响

CCK-8结果显示，1.25和2.5 mg/mL的Bio-Poly P在24、48、72小时均未抑制细胞增殖，而≥5 mg/mL则显著抑制增殖（P < 0.0001）。因此后续实验选用0.25–2.5 mg/mL浓度。

3.3 Bio-Poly P促进hPDLSCs成骨分化

第7天时，0.25、1.25、2.5 mg/mL Bio-Poly P均显著上调COL1A1表达（P < 0.0001），仅1.25 mg/mL增强OCN（P < 0.0001）和OPN（P < 0.01）表达，对RUNX2无影响。至第14天，所有浓度均显著提升RUNX2、OCN、OPN、COL1A1表达。ALP活性和定量分析显示，0.25和1.25 mg/mL组在第7、14天均显著提高ALP活性（P < 0.0001），2.5 mg/mL组无显著差异。ARS染色表明1.25 mg/mL组矿化结节形成最显著。

3.4 Bio-Poly P促进体内牙周骨再生

微CT显示，Bio-Poly P和Bio-Oss?组均能恢复牙槽骨高度、减少根分叉处骨吸收。定量分析表明，Bio-Poly P显著提高BMD、BV/TV和Tb.Th（P < 0.05），效果与Bio-Oss?相当（P > 0.05）。H&E染色可见Bio-Poly P组大量新骨形成及牙骨质样结构，未处理组则再生有限。

4 讨论

本研究证实生物合成的中链Bio-Poly P具有良好的生物相容性和成骨诱导能力。其机制可能涉及激活FGF信号通路、ALP水解释放磷酸盐促进羟基磷灰石成核，以及调节细胞内钙浓度。浓度过高（≥5 mg/mL）可能通过改变渗透压或诱导凋亡抑制细胞增殖，因此适宜浓度至关重要。

Bio-Poly P的环保合成策略大幅降低成本与环境污染，为牙周再生提供了可持续的新型生物材料。未来可探索其与金属离子复合应用以及在炎症微环境（如牙周炎模型）中的综合再生效果。

5 结论

Bio-Poly P能有效促进hPDLSCs成骨分化并在体内增强牙周骨缺损修复，效果与临床标准材料相当，具备作为牙周再生治疗替代材料的潜力。