基于脑脊液无细胞DNA完整性与补体C4d的液体活检新策略：揭示副肿瘤性与非副肿瘤性自身免疫性脑炎的生物标志物

本研究创新性地提出脑脊液（CSF）中无细胞DNA（cf-DNA）完整性指数（cfDI）与补体裂解产物C4d可作为自身免疫性脑炎（AE）的新型液体活检标志物。cfDI（ALU-247/ALU-115比值）升高提示坏死性细胞死亡主导，而C4d显著区分副肿瘤性AE（AUC=0.818）。二者协同揭示中枢神经系统（CNS）组织损伤与免疫激活机制，为AE的早期诊断、分型及疗效监测提供新视角。

　　

1 引言

免疫介导的脑炎包括经典的副肿瘤性脑炎综合征（常与针对细胞内神经元蛋白的抗体相关）和与神经元细胞表面/突触蛋白抗体相关的脑炎综合征（通常称为自身免疫性脑炎，AE）。副肿瘤综合征几乎总是与潜在肿瘤相关，而AE则可能伴或不伴癌症，其关联风险因抗体类型而异。近期诊断标准强调不同抗体表型的癌症风险谱系，将其分为高风险和中风险组，以优化对这些异质性疾病的临床管理。

AE发病机制中的重要环节包括自身抗体对表面抗原表达细胞的功能性影响（如抗原表达减少、受体交联、内吞降解、细胞通讯中断），以及受累中枢神经系统（CNS）组织中B细胞、浆细胞的存在和小胶质细胞激活。在某些严重病例的病理数据中，还观察到不同程度的补体激活。然而，每种抗体（及其亚类）在体内触发补体激活的倾向尚不明确。在副肿瘤性脑炎中，抗体被认为无致病性，无补体激活特性，其免疫病理学表现为T细胞浸润和显著神经元丢失。尽管对AE免疫发病机制的理解有所进展，但反映组织特异性损伤和免疫激活的可靠液体生物标志物仍稀缺，尤其在区分副肿瘤与非副肿瘤形式方面。

上述组织异常可能导致细胞游离基因组DNA片段（即循环无细胞DNA，cf-DNA）进入循环和脑脊液。Cf-DNA是存在于体液中的外部化、不同长度的片段化DNA，是程序性细胞死亡、坏死或细胞激活的产物。循环cf-DNA的序列携带有关组织来源及其病理的生物学信息，如染色体重排、微卫星改变、点突变、插入缺失、多核苷酸多态性、杂合性丢失、拷贝数变异和表观遗传变化。在凋亡过程中，DNA在核小体间区域被切割，产生约167–180碱基对（bp）的特征性片段（即核小体包裹的DNA长度），以及多核小体形式（如二核小体~360 bp、三核小体~540 bp），形成著名的“凋亡 ladder”模式。相比之下，坏死和其他非程序性细胞死亡途径导致更长、更异质的DNA片段释放，这些片段优先被ALU-247引物扩增。Cf-DNA完整性（cfDI）通过较长DNA与较短DNA的比值（ALU重复序列247 bp和115 bp的比率）来衡量。ALU重复序列是人类基因组中最主要的短散布重复序列，拷贝数超过一百万 copies/genome。这些较长片段并非 exclusively 源自坏死，因为凋亡过程也能产生多核小体cf-DNA片段。因此，cf-DNA完整性指数（cfDI = ALU-247/ALU-115）被广泛用作 longer cf-DNA片段相对增加的 probabilistic 指标，可能反映坏死或其他非凋亡细胞死亡途径的贡献大于凋亡 alone。除肿瘤学外，cf-DNA完整性已在神经退行性和自身免疫性疾病中开始探索，其中增加的cfDI值与复杂的神经元损伤相关，涉及坏死性凋亡、细胞焦亡和炎症性胞外诱捕网形成。尽管这些领域的数据相对稀少，但这一新兴证据凸显cf-DNA完整性作为研究多种病理细胞死亡机制的有前景的生物标志物。

此外，细胞核外的DNA可作为损伤相关分子模式（DAMP），这在DNA酶缺陷小鼠模型中已明确显示。从系统性自身免疫病患者血清中分离的细胞游离核酸可启动健康单核细胞中NLRP3（NOD样受体家族pyrin结构域包含3）和AIM2（黑色素瘤缺失2）炎症小体的激活，表明细胞外DNA的致炎潜力。先前研究表明，AE患者脑脊液中白细胞介素-6（IL-6）水平升高指示神经炎症程度，抗IL-6药物（托珠单抗）已被提议作为难治性病例的治疗选择。此外，在抗NMDAR脑炎中，疾病严重程度高和预后差的患者具有更高的脑脊液Th17细胞百分比和IL-17A水平。

本研究旨在定量评估伴或不伴潜在肿瘤的各种形式AE患者脑脊液和血浆中基因组cf-DNA的存在，其中cfDI可告知组织破坏和细胞死亡的类型。我们进一步旨在将cf-DNA生物学的各个方面与临床和放射学参数、炎症细胞因子（IL-17A、IL-6）和补体C4d水平相关联。选择这些细胞因子是因为它们在神经炎症级联中的既定作用以及与cf-DNA诱导的免疫激活通路相互作用的潜力。补体C4d是经典和凝集素途径激活的稳定标志物，比其他片段（如C3a和C5a）持久，后者迅速被清除。其在自身免疫和癌症相关炎症中的既定作用支持其作为本研究相关生物标志物的选择。识别此类生物标志物可能有助于早期诊断、指导免疫治疗升级以及区分肿瘤相关与特发性AE形式——这些挑战在当前临床实践中持续存在。

2 方法

2.1 研究人群

共纳入48名成人（30名患者和18名对照）。所有招募的患者均在2012–2024年期间住院于雅典国立和卡波迪斯坦大学神经内科第一系。所有受试者和/或其近亲（在意识模糊情况下）提供了书面知情同意。该研究获得了Aeginition医院科学委员会和伦理委员会的批准（428/26.5.22），并根据1964年赫尔辛基宣言的伦理指南进行。

30名患者满足Graus等人定义的AE标准。未检测到已知自身抗体（血清或脑脊液中）的患者被排除。

患者细分为那些检测到细胞内抗原和 amphiphysin 抗体者（n = 15）和那些检测到细胞外抗原抗体者（n = 15）。具体而言，脑炎患者为治疗初治，其脑脊液在综合征急性发作期间采样。脑脊液对病毒DNA和其他病原体（包括结核和隐球菌）呈阴性。

对照组由18名年龄和性别匹配的个体组成。18人中有14人是接受小手术（如疝修补术或膝关节手术 under 脊髓麻醉）的健康对照，18人中有4人是头痛患者（2例正常压力脑积水和2例非特异性白质病变）。先前研究表明，脊髓麻醉下的小手术通常不会引起炎症细胞因子（如IL-6）的显著或持续升高。对于血浆生物标志物分析，12名对照和15名患者有可用样本。对照组无认知主诉，无神经、精神或其他重大疾病。他们均通过基于简易精神状态检查（MMSE）的半结构化访谈评估认知功能正常。

2.2 诊断评估

所有病例回顾性收集初诊时的人口学和临床数据。还报告了潜在恶性肿瘤的存在。所有患者接受了完整的身体和神经学检查，评估局灶性和周围症状/体征、自主神经功能障碍、精神症状、认知障碍和运动障碍。所有患者进行了一系列神经心理学测试，包括 a) MMSE, b) 额叶评估电池（FAB）, c) 5词即时和延迟回忆（5WT）, 和 d) 15点自发和复制CLOX绘图（分别为CLOX1和2）测试。采用改良Rankin量表（mRS）临床评分估计首次发作入院时的症状严重程度，如先前在AE患者中所用。

患者初次住院时的辅助检查包括脑电图（EEG）；肌电图（EMG）；3 Tesla脑磁共振成像（MRI）；腹部、胸部和骨盆计算机断层扫描（CT）以排除并发肿瘤存在。必要时进行全身正电子发射断层扫描和计算机断层扫描（PET-CT），特别是在具有高风险副肿瘤抗体的患者中。诊断时，30名患者中11名检测到癌症。更具体地说，一名抗Ma2抗体患者被诊断出食管癌。两名NMDAR脑炎患者发现囊性畸胎瘤。在抗Yo抗体患者中，两名被诊断出癌症——一名子宫内膜癌和一名前列腺癌。抗Zic4抗体患者被诊断出纵隔癌。此外，五名患者发现肺癌：三名具有多种抗体（抗CV2和抗Hu；抗CV2和抗Yo；以及抗GAD、抗Hu和抗CV2），一名抗CV2，一名抗Hu抗体患者。

当T2加权液体衰减反转恢复序列上高信号严格限于一侧或双侧内侧颞叶（边缘叶脑炎），或涉及灰质、白质或两者的多灶区域，与脱髓鞘或炎症相容时，MRI指示脑炎。

使用标准市售检测法检测血清和/或脑脊液中的抗体 panel；针对细胞内抗原（Hu、Ri、Yo、amphiphysin、CV2/CRMP5、Ma2/Ta、Zic-4、Tr [DNER]、Recoverin、GAD65、SOX1）的抗体通过免疫印迹技术识别，而针对细胞外（NMDAR、AMPAR、LGI1、Caspr-2、GABAb1R、GlyR）和Kelch-11抗原的抗体通过固定细胞基于 assays 评估。

2.3 无细胞DNA的分离和配对脑脊液与血浆样本的定量评估

脑脊液和血浆样本按照标准方案收集。脑脊液通过腰椎穿刺获取到无菌管中并立即置于冰上以最小化核酸降解。血浆样本收集在EDTA管中并迅速处理。脑脊液和血浆样本均在4°C下以1,500g离心10分钟以去除细胞碎片。上清液小心转移到新管中，不扰动沉淀。样本要么立即处理，要么在-80°C储存， freeze–thaw 循环最少以保持cf-DNA完整性。

从患者血浆和脑脊液（720 μL）中分离cf-DNA，使用 NucleoSpin^? cf-DNA XS Kit（MACHEREY-NAGEL, Germany），该试剂盒从相对较低的初始样本量（240–720 μL血浆或脑脊液）中分离游离核酸，并在程序结束时产生足够量的cf-DNA用于下游应用。选定的血浆和脑脊液样本通过 NucleoSnap cf-DNA kit（MACHEREY-NAGEL, Germany）处理，需要1至3 mL初始样本体积。Cf-DNA片段在 Agilent 4150/4200 TapeStation（2 μL cf-DNA）中分析。通过该方法，回收的cf-DNA tested for quality and chain integrity。使用 High Sensitivity D100 TapeStation Kit 进行电泳分析，使用约2 μL从脑脊液洗脱的DNA。由于从少于1 mL脑脊液分离的cf-DNA量低，cf-DNA在 TapeStation 上不明显。在 cell-free 范围（150–200 bp）内无DNA峰并不排除用RT-PCR进行下游处理，因为浓度可能低于 TapeStation assay 的检测限。为此，在选定患者中，我们从更大起始量的脑脊液（1–3 mL）分离cf-DNA，这导致了 characteristic patterns（指示单核小体片段的峰大小）。

使用定量实时PCR技术（RT-PCR）定量cf-DNA。进行定量PCR（qPCR）以估计两种ALU重复元素（ALU-115和ALU-247）的拷贝数，并计算DNA完整性（cfDI）为ALU-247/ALU-115比率。每个RT-PCR的反应混合物包括模板序列（1 μL标准基因组DNA和cf-DNA），0.2 mM正向和反向引物，和1× SYBR Green Master Mix，总体积20 μL。

通过qPCR定量cf-DNA，通过与已知浓度的基因组DNA（gDNA）标准比较，使用靶向核编码管家基因（β-globin）（β-globin-F: GTGCACCTGACTCCTGAGGAG, β-globin-R: CCTTGATACCAACCTGCCCAG），ALU序列（ALU-115-F: CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG, ALU-115-R: CCCGAGTAGCTGGGATTACA; ALU-247-F: GTGGCTCACGCCTGTAATC, ALU-247-R: CAGGCTGGAGTGCAGTGG）的引物。使用已知浓度的gDNA（男性DNA，Applied Biosystems, Foster City, CA, USA），我们制备了系列稀释的基因组DNA样本 at various concentrations（10 ng/mL, 1 ng/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 1 pg/mL）作为qPCR标准。样本运行三次以获取相对于标准曲线的样本平均浓度。初步实验后，我们得出结论，适当的RT扩增包括：95°C预循环热激活DNA聚合酶3分钟，随后40个循环的95°C变性30秒，60°C和64°C退火30秒（分别为β-globin和ALU序列），72°C延伸30秒，最后72°C最终延伸10分钟（StepOne Plus）。

2.4 脑脊液和血浆中炎症细胞因子水平和C4d的测定

使用 Sandwich ELISA kits（IL-6和IL-17A，均来自 e-Bioscience, San Diego, USA）根据制造商说明书（未稀释样本）量化脑脊液和血浆中炎症相关细胞因子的水平。使用 C4d MicroVue? EIA（Quidel, San Diego, USA）根据制造商说明书在相应队列的血浆样本（1:100稀释）和未稀释脑脊液中量化C4d。

2.5 统计分析

数据表示为均值±SD或中位数（范围）。使用SPSS version 20.0（IBM Corp., Armonk, NY, USA）进行统计分析。执行独立样本非参数检验以比较患者和对照之间脑脊液cf-DNA或炎症细胞因子/补体的水平。随后，为测试所测生物标志物的敏感性和特异性，应用了受试者工作特征（ROC）曲线。使用Pearson检验评估定量参数之间的相关性；使用Spearman检验评估mRS评分与定量参数之间的相关性。p值<0.05被视为 statistically significant。

3 结果

3.1 脑炎患者的人口学和临床特征

AE患者（n = 30）的人口学数据和临床特征如表1所示。对照组平均年龄60 ± 10 SD，女性/男性比率为1。AE队列平均年龄59岁，52%为女性患者。然而，细胞内抗体患者的平均发病年龄（68.87 ± 11.29岁）显著高于神经元表面抗体患者（49.33 ± 19.78岁，p = 0.0038）。组间性别分布无显著差异（均为53.3%女性患者）。30名AE患者中，15名（50%）有针对细胞内抗原的抗体，包括Ma2（1/30, 3.3%）、Yo（3/30, 10%）、Zic-4（1/30, 3.3%）、amphiphysin（1/30, 3.3%）、GAD65（2/30, 6.6%）、Hu（1/30, 3.3%）、KLHL-11（1/30, 3.3%）和多种细胞内抗体（主要为抗Hu；5/30, 16.6%）。其余15名患者（50%）有针对神经元表面/细胞外抗原的抗体：NMDAR（6/30, 20%）、Caspr2（4/30, 13.3%）、GlyR（3/30, 10%）、GABAA R（1/30, 3.3%）和LGI1（1/30, 3.3%）。

常见 presenting symptoms 包括精神障碍（33.2%）、记忆缺陷（46.6%）和癫痫发作（46.6%）。抗体组间在 several symptoms 上观察到显著差异：认知衰退在神经元表面抗体患者中更频繁（53.3% vs. 6%，p = 0.014），行为改变（46.6% vs. 6%，p = 0.035）和癫痫发作（46.6% vs. 0%，p = 0.006）也是如此。50%患者注意到与脑炎相关的T2/FLAIR高信号，66.6%有EEG异常。其他运动症状包括自主神经紊乱、帕金森症、肌张力障碍、小脑性共济失调、口面部和肢体运动障碍、眼阵挛和获得性过度惊厥。 among movement disorders，小脑性共济失调在细胞内抗体组中显著更常见（33.3% vs. 0%，p = 0.041）。其他 signs，如自主神经功能障碍、帕金森症、肌张力障碍、口面部/肢体运动障碍、眼阵挛和获得性过度惊厥，组间无显著差异。然而，两组间改良Rankin量表（mRS）评分无显著差异（中位mRS = 4）。总体而言，这些数据突出了与抗体类型相关的 distinct clinical phenotypes，细胞内抗体与 older age and cerebellar ataxia 相关，而神经元表面抗体与癫痫发作、认知衰退和行为症状相关。

3.2 自身免疫性脑炎患者脑脊液中的无细胞DNA和无细胞DNA完整性

实验工作流程的示意图概述，包括血浆和脑脊液cf-DNA、细胞因子（IL-17A和IL-6）和补体裂解产物C4d的定量，以及代表性RT-PCR标准曲线，如图1所示。AE患者脑脊液cf-DNA水平显著高于对照（p < 0.0001）（图2A）。我们接下来评估了脑脊液中两种重复元素的浓度；因此，扩增并定量了一个短片段（ALU-115）和一个长片段（ALU-247）。AE患者和对照之间ALU-247（坏死相关）水平无显著差异，但注意到AE患者ALU-115（凋亡相关）水平轻微增加（p < 0.0247）（图2B,C）。因此，cfDI（表示为ALU-247/ALU-115比率）表现出广泛变异性但无组水平差异（图2D）。最高cf-DNA水平在GlyR、LGI1和NMDAR抗体阳性患者以及显示针对多种细胞内抗原抗体的患者中检测到（图2E）。高于0.006 ng/μL的cf-DNA水平可以区分对照和AE患者，敏感性81%（95% CI: 62.12% to 91.5%），特异性83%（95% CI: 60.78% to 94.16%）（图2F）。

高脑脊液ALU-115水平的患者更频繁地出现指示脑炎的MRI异常（如方法中所述）。此外，具有 increased ALU-247/ALU-115比率（cfDI）的AE显示EEG异常（指示癫痫活动）（图2G,H）。存在脑脊液 oligoclonal bands（OCBs）的患者具有更高的ALU-115水平（p = 0.0141）（数据未显示）。 collectively，这些发现表明脑脊液中cf-DNA的特定元素与疾病活动指数相关。

3.3 自身免疫性脑炎患者脑脊液中的炎症细胞因子和C4d水平

为进一步评估体液免疫和补体在AE发病机制中的作用，我们通过ELISA测量了脑脊液中炎症相关细胞因子IL-6和IL-17A以及补体裂解产物C4d的水平。AE患者脑脊液IL-17A和补体裂解产物C4d水平显著高于对照（均p < 0.001），而IL-6水平无显著差异（图3A–C）。值得注意的是，C4d在携带多种自身抗体的患者中 predominantly elevated（图3D）。在所有测试的生物标志物中，脑脊液C4d在区分AE患者和对照方面表现出最高的诊断性能（AUC = 0.915）（图3E）。更具体地说，高于0.09 pg/mL的C4d浓度阈值指示AE，敏感性85.71%（95% CI: 65.6% to 95.02%），特异性78.57%（95% CI: 52.41% to 92.43%）。表2总结了脑脊液生物标志物的诊断性能，包括其AUC、敏感性、特异性和最佳 cutoff，提供了它们区分AE患者与对照准确性的直接比较。

脑脊液C4d水平与神经炎症标准标志物显著相关，包括脑脊液白细胞计数（r = 0.464, p = 0.0339）、蛋白水平（r = 0.5242, p = 0.0147）和mRS残疾评分（r = 0.507, p = 0.018）（补充图2）。与脑脊液 compartment 中的显著差异相反，在AE患者中观察到血浆β-globin（p = 0.0138）和C4d（p = 0.1）轻微增加，强调了CNS补体激活的 localized nature（补充图3）。在血浆中，关于炎症细胞因子和cfDI水平未发现差异， expecting a trend toward more C4d plasma levels in AE patients。如补充图4所示，在AE患者中，血浆和脑脊液 compartments 之间未观察到分子和蛋白质生物标志物之间的强或一致相关性。这突出了自身免疫性脑炎中免疫反应的 compartmentalized nature，并 reinforce 了脑脊液特异性分子分析比血浆 based markers 提供更可靠的CNS特异性免疫机制 insights（补充图4）。

3.4 副肿瘤性脑炎中的脑脊液无细胞DNA完整性和C4d水平

为探究AE患者和对照之间的差异是否由特定亚组驱动，我们将AE患者分为 those with antibodies against intracellular antigens and those with antibodies against extracellular antigens。我们发现，与细胞外抗原抗体患者相比，细胞内抗原抗体AE患者的脑脊液C4d水平显著增加，且ALU-247/ALU-115比率增加（p < 0.001 and p < 0.05, respectively）（图4A–C）。ALU-247/ALU-115比率在具有高风险副肿瘤抗原（如Kelch-11、Yo和Hu）抗体的AE患者中 particularly increased（图4D）。脑脊液C4d水平在区分细胞内抗原抗体与细胞外抗原抗体AE患者方面显示出最佳辨别能力（图4E）。

此外，我们选择了在脑炎诊断时具有肿瘤诊断的患者，包括两名患有畸胎瘤的NMDAR脑炎患者，并将他们与无并发肿瘤的患者进行比较。各种测试的可能诊断生物标志物预测脑炎患者疾病诊断时肿瘤存在的ROC曲线分析显示，C4d具有最佳辨别能力（AUC = 0.8182, 95% CI: 0.6310 to 1.000）（图4F）。

4 讨论

尽管对免疫介导性脑炎进行了广泛研究，但在其发病机制、诊断生物标志物、预后指标和治疗反应预测因子方面仍存在 significant gaps。在疾病 presentation 时，排除潜在肿瘤的存在很重要，因为这一知识可以指导 further therapeutic strategies。此外，在副肿瘤性脑炎中，潜在肿瘤的存在可能在随访的接下来几年中显现。因此，寻找疾病生物标志物至关重要；然而，由于异常部位的解剖位置和血脑屏障（BBB）的存在，最合适和常用的方法涉及CNS的非侵入性探测。

我们的病例对照研究提出了对脑脊液循环组织损伤生物标志物（如cf-DNA及其组分）以及补体裂解产物C4d在免疫介导性脑炎中意义的新理解。除总浓度外，cf-DNA携带定性信息，包括组织特异性甲基化模式和炎症潜力。增加的cf-DNA浓度与退行性和自身免疫性疾病、缺血和创伤中的细胞死亡过程相关。在肌萎缩侧索硬化（ALS）中，血清cf-DNA由于骨骼肌来源的DNA而升高，如甲基化分析所揭示，且最近发现线粒体DNA升高。在阿尔茨海默病中，血浆cf-DNA包含神经元组织特异性甲基化基因（如LHX2在CpG位点1和5），表明其作为外周神经退行性标志物的潜力。在视神经脊髓炎谱系障碍（NMOSD）中，血清cf-DNA主要来自中性粒细胞并诱导I型干扰素反应，说明其炎症潜力。这些发现表明cf-DNA是生物标志物开发的有前景工具，并在CNS疾病中提供机制 insights，尽管需要 dedicated 脑脊液研究以确定其相关性。

cfDI（测量较长与较短DNA片段的比例）可作为各种肿瘤疾病、自身免疫性疾病和心肌梗死中潜在的诊断和预后生物标志物，但其在自身免疫性脑炎中的应用证据仍然有限。本研究中cfDI的分析显示，细胞内抗原抗体患者的脑脊液中释放更多坏死DNA（ALU-247/ALU-115比率增加）。鉴于自身免疫性脑炎的罕见性和异质性，我们的研究 necessarily based on a modest cohort size。虽然这一背景并不削弱我们观察结果的生物学相关性，但它强调了在 larger, independent series 中复制发现之前需要谨慎解释。

关于脑脊液C4d测量，我们在具有细胞内抗体且并发肿瘤存在的AE患者中发现水平增加。副肿瘤性AE的组织病理学标志涉及CD8 T细胞浸润和细胞毒性T细胞驱动的颗粒酶B、穿孔素和Fas/Fas配体释放，导致不同程度的神经元丢失。补体C5b-9末端复合物未在受累CNS组织中检测到。此外，针对细胞内抗原的抗体通常不被认为具有致病性。然而，一些体外证据支持某些这些抗体（抗Yo和抗Hu）与神经元的结合和内化，可能 contribute to subsequent neuronal injury。这些结果存在争议，且主动免疫 with proteinic autoantigens 或被动转移自身抗体的动物模型并未重现相关副肿瘤性疾病的关键特征。在活检或尸检材料中，关于神经元细胞死亡 precise type（凋亡、坏死、细胞焦亡）和各种补体成分的数据缺乏。尸检研究显示，神经元细胞丢失在7例 onconeural 病例中的5例、3例GAD病例中的2例和7例表面抗原（VGKC复合物）病例中的1例中 prominent。最严重的神经元丢失发现于1例抗Hu、1例抗Ma2、1例抗GAD和1例抗VGKC复合物病例中。神经元附近IgG沉积的证据已被记录。

在具有表面抗原抗体的AE中，自身抗体 confer functional perturbations，如受体阻断。补体激活的证据因特定抗原而异。例如，补体可加剧某些具有抗甘氨酸受体抗体、抗GABAb受体脑炎和一小部分抗Caspr-2抗体相关脑炎患者的抗体介导破坏。此外，在LGI1 AE患者的活检材料中 previously observed 激活补体蛋白的沉积。其他尸检和活检NMDAR脑炎病例显示补体在肿瘤中沉积，但不在脑中，尽管存在局部IgG。补体激活的直接细胞毒性已在GAD-Ab相关脑炎患者中得到证明，他们表现出补体蛋白基因（C3、C4A、C4B）的转录水平增加和脑脊液中激活补体蛋白水平升高。

在我们的研究中，升高的脑脊液补体裂解产物C4d水平与脑炎患者的肿瘤存在以及脑脊液中白细胞的存在相关。脑脊液C4d的组织起源需要进一步研究。任何评估患者中均无血清低补体血症，表明外周无C4消耗。在NMDAR患者中，畸胎瘤在其神经组织中表现出补体存在， unlike the brain，后者缺乏补体沉积。C4d可通过经典或凝集素途径产生，并且需要多价配体进行激活。透明细胞肾细胞癌（ccRCC）肿瘤中的癌细胞表现出补体丰富表型，而血清C4d与恶性间皮瘤中的肿瘤体积相关。因此，假设肿瘤来源的C4d（可能通过微泡释放到血浆中）是