乳酸通过HCAR1/β-Arrestin2/PP2A信号轴介导STAT1/2去磷酸化并驱动骨肉瘤进展的机制研究

本文揭示了乳酸通过激活HCAR1受体，经β-Arrestin2介导招募PP2A磷酸酶，促使STAT1/2发生酪氨酸位点（Y701/Y690）去磷酸化，进而抑制其下游抑癌基因转录，最终驱动骨肉瘤（OS）恶性进展的新机制，为靶向代谢微环境的OS治疗提供了新策略。

　　

HCAR1上调预示骨肉瘤不良预后

通过分析TCGA肉瘤数据库发现，HCAR1（GPR81）的表达与肉瘤患者生存预后呈负相关，而HCAR2和HCAR3无此相关性。qRT-PCR和Western blot检测显示，HCAR1在骨肉瘤（OS）组织中的mRNA和蛋白水平均显著高于其他肉瘤类型（如软骨肉瘤、尤文肉瘤和脂肪肉瘤）及癌旁正常组织。对80例OS样本的免疫组化分析进一步证实，HCAR1高表达（++及+++）与肿瘤进展无生存期（PFS）和总生存期（OS）缩短显著相关，同时肺转移发生率更高。多因素分析表明，HCAR1高表达是Enneking分期III期、复发和肺转移的独立危险因素。

乳酸激活HCAR1促进OS细胞增殖与迁移

骨肉瘤细胞表现出显著的“Warburg效应”，其胞外乳酸浓度显著高于骨髓间充质干细胞（BMSCs）。HCAR1在OS细胞系（如MG63和143B）中的表达也显著上调。功能实验表明，乳酸以剂量依赖性方式促进OS细胞增殖，最佳激活浓度为10 mM。通过慢病毒感染构建HCAR1过表达或敲低细胞系，发现HCAR1过表达可增强细胞增殖、软琼脂克隆形成、迁移和侵袭能力，并促进细胞周期G2/M期转换；而HCAR1敲低则显著抑制这些恶性表型。值得注意的是，乳酸对HCAR1敲低细胞的促癌作用被显著削弱，提示HCAR1是乳酸信号传导的关键受体。

乳酸激活HCAR1抑制STAT1/2转录活性

利用CRISPR-Cas9技术构建HCAR1敲除的143B细胞系，RNA测序结果显示，乳酸刺激后，野生型与HCAR1敲除细胞之间存在277个差异表达基因。KEGG和GO富集分析提示这些基因主要富集于JAK-STAT信号通路。ChIP-X富集分析（ChEA3）显示，STAT1和STAT2是调控这些差异基因的关键转录因子。进一步验证发现，乳酸激活HCAR1后，STAT1/2的14个共同靶基因（如IFITM1、EPSTI1、TNFSF10、TRIM22、IFI27、BST2、IFI6、IFI44L、XAF1、OAS1、OAS2、IRF9、MX2和MX1）的表达显著下调，其中5个基因（IFI44L、TRIM22、OAS1、OAS2、MX2）被证实具有抑癌功能，其高表达与OS患者良好预后相关。

β-Arrestin2介导乳酸/HCAR1对STAT1/2去磷酸化的下调信号

STAT1/2的转录活性依赖于其酪氨酸磷酸化（STAT1 Y701和STAT2 Y690）。Western blot和免疫荧光实验表明，乳酸刺激可显著降低野生型OS细胞中STAT1/2的磷酸化水平，而HCAR1敲除或敲低则逆转这一效应。使用Gi/o蛋白抑制剂百日咳毒素（PT）处理并不能阻断乳酸介导的STAT1/2去磷酸化，提示HCAR1通过非经典途径发挥作用。进一步通过CRISPR-Cas9构建β-Arrestin1和β-Arrestin2敲除细胞系，发现β-Arrestin2敲除可完全消除乳酸/HCAR1对STAT1/2磷酸化的抑制作用，而β-Arrestin1敲除无此效应，表明β-Arrestin2是HCAR1信号传导的关键支架蛋白。

乳酸激活HCAR1通过β-Arrestin2增强PP2Aα与STAT1/2的结合

通过免疫共沉淀（Co-IP）联合液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析，发现PP2Aα是STAT1/2的结合蛋白之一。Co-IP实验证实，乳酸刺激可显著增强STAT1/2与PP2Aα及β-Arrestin2之间的内源性结合，而HCAR1敲除则阻断这一过程。双分子荧光互补（BiFC）和邻近连接实验（PLA）进一步验证了乳酸促进PP2Aα-STAT1/2复合物形成的现象。分子机制研究表明，β-Arrestin2的N端α-螺旋结构域（Δ84–173）与STAT1/2结合，其C端与PP2Aα相互作用，从而支架PP2Aα与STAT1/2形成功能复合物。

抑制PP2A去磷酸化STAT1/2过程可阻断乳酸/HCAR1/β-Arrestin2的促癌效应

使用PP2A选择性抑制剂Endothall处理OS细胞，发现其可完全逆转乳酸介导的STAT1/2去磷酸化，并显著上调STAT1/2靶基因的表达。功能实验表明，Endothall处理能抑制OS细胞的增殖、迁移、侵袭和细胞周期进程，并促进凋亡。体内实验进一步证实，Endothall单药或与顺铂联用可显著抑制裸鼠皮下成瘤和肺转移，且联合用药表现出协同抗肿瘤效应。Western blot分析肿瘤组织发现，Endothall处理组STAT1/2磷酸化水平显著升高，而顺铂单药组无此变化，提示PP2A是调控STAT1/2磷酸状态的关键分子。

OS样本中HCAR1与Ki67共表达而与磷酸化STAT1/2分离

对临床OS样本进行多重免疫荧光染色，发现HCAR1阳性细胞同时高表达增殖标志物Ki67，而磷酸化STAT1/2（p-STAT1/2）信号缺失或微弱；相反，HCAR1阴性细胞则呈现低Ki67表达和高p-STAT1/2水平。这一结果在临床层面验证了HCAR1表达与细胞增殖正相关、与STAT1/2磷酸化负相关的现象。

结论

本研究系统阐明了乳酸通过激活HCAR1受体，经β-Arrestin2支架作用招募PP2A磷酸酶，介导STAT1/2酪氨酸去磷酸化，从而抑制其下游抑癌基因转录，最终促进OS恶性进展的分子机制。靶向该信号轴（如使用PP2A抑制剂Endothall）可有效抑制OS生长和转移，并与化疗药物顺铂产生协同效应，为OS的靶向治疗提供了新思路。