混凝土结构启发的3D打印框架增强两性离子水凝胶力学性能用于高效预防术后腹腔粘连

本文推荐一种受混凝土结构启发的创新复合材料3DF-LH，它通过3D打印聚己内酯（PCL）框架（3DF）增强甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（SBMA）水凝胶的力学性能，兼具内部高拉伸强度（4.43±0.14 MPa）和外部优异润滑性，有效解决了传统两性离子水凝胶机械脆弱和结构不稳定的临床转化瓶颈。体内外实验证实其能显著抑制成纤维细胞粘附、减轻炎症微环境并下调TGF-β/Smad信号通路，为大面积腹腔术后粘连的防治提供了具有临床转化潜力的新策略。

　　

1 引言

术后腹腔粘连是腹部手术后最常见的并发症，可导致慢性盆腔疼痛、女性不孕、肠梗阻甚至死亡风险。传统可注射水凝胶面临力学性能与生物相容性/界面润滑性之间的根本性权衡。尽管透明质酸（HA）膜等固体屏障通过界面润滑预防粘连，但其固有的机械脆性限制了临床应用。值得注意的是，HA膜等材料的抗粘连功能所依赖的界面润滑机制与更基本的生物学机制——水合润滑——相一致；该过程依赖于两性离子聚合物通过离子-偶极相互作用形成结合水壳，从而提供必要的抗粘连效果。然而，这一机制关键取决于界面水合动力学，使得润滑性水凝胶在生理应力下 inherently 易发生结构失效。

受建筑工程中混凝土的框架增强复合结构启发，本研究开发了一种3D打印聚合物框架增强的两性离子润滑水凝胶（简称3DF-LH），其内部具有高拉伸强度，外部具有最佳润滑性。类似于混凝土的建立过程，3DF-LH是通过将包含GelMA和两性离子磺基甜菜碱甲基丙烯酸酯（SBMA）的水凝胶前体溶液渗透到3D打印的PCL框架（3DF）的孔隙中，然后进行UV固化制备而成。

2 结果与讨论

2.1 3DF-LH的制备与表征

3DF-LH通过将3D打印的PCL框架与光聚合的GelMA和SBMA水凝胶封装而成。宏观评估显示冻干的水凝胶基质完全包裹了框架。冻干的3DF、3DF-H和3DF-LH的SEM图像显示出不同的微观结构架构：3DF-LH和3DF-H组均呈现均匀的多孔水凝胶网络结构。功能表征表明，其水蒸气透过率（WVTR）和氧渗透系数（OPC）显著超过商业产品Tegaderm，证实了其优异的临床适用性。增强的WVTR和OPC特性促进了营养物/代谢物的交换，同时有利于炎症细胞（如巨噬细胞）的募集，从而为组织再生创造了最佳条件。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）结果证实SBMA成功化学整合到GelMA网络中。光聚合后的光谱显示1630–1640 cm^?1处的C═C键伸缩峰显著减弱，同时在1151 cm^?1处出现了磺酸基振动峰，验证了两性离子SBMA部分的共价掺入。通过调整3D打印过程中的线条设计，制造了三种不同的构型：0°-90°、0°-45°-90°和0°-30°-60°。拉伸测试显示所有支架类型均具有显著的各向异性力学性能。所有组的拉伸强度均超过3 MPa，大大超过了腹腔抗粘连屏障的要求。0°-90°构型表现出最大拉伸强度4.30 ± 0.34 MPa，同时保持约208.03 ± 31.11%的可比断裂伸长率。此外，压缩测试证实0°-90°构型表现出最高的压缩模量，达到9.30 ± 0.09 MPa。这种优化的线条设计实现了刚度与抗变形性之间的理想平衡，确保了与腹部组织的良好顺应性，同时提供了针对潜在器官表面暴露的 robust 保护。基于这些发现，选择0°-90°图案框架用于后续实验研究。

2.2 体外降解与溶胀特性

材料的可降解性是植入式生物支架的一个基本特征，因为停留时间短的物理屏障在预防术后粘连方面效果不足。为了评估降解行为，将3DF、3DF-H和3DF-LH样品在补充了胶原酶II的PBS中进行14天的重量分析。所有组在终点时保留了超过88%的初始质量，其中3DF-LH表现出 superior 的结构稳定性（质量保留率89.4 ± 2.1%）。这种在粘连形成关键窗口期（术后3-5天）的持续完整性确保了屏障功能的连续性，从而解决了传统物理屏障（如透明质酸膜，在48-72小时内降解）过早溶解的临床局限性。

除了抗降解性，抑制溶胀对于有效的抗粘连屏障也至关重要。从机制上讲，两性离子基团通过静电吸引与水分子协调形成致密的氢键网络，这些网络将凝胶基质包裹在稳定的水合层中。这种分子结构动力学上阻碍了自由水扩散到网络中，从而抑制了平衡溶胀。与这一机制一致，3DF-LH在PBS中浸泡48小时后表现出 outstanding 的抗溶胀效果，其溶胀比低。尽管相对于3DF-H表现出加速的溶胀动力学（在24小时内达到平衡——快两倍），但3DF-LH实现了显著更低的平衡溶胀比（8.81 ± 1.50），与3DF-H相比减少了46%。

2.3 生物相容性评估

细胞相容性是水凝胶基抗粘连屏障临床应用的 paramount 先决条件。选择PCL、GelMA和SBMA是基于它们已报道的生物相容性特性。使用活/死染色和CCK-8 assay评估NIH/3T3成纤维细胞活力。活/死成像显示，在第3天和第7天，10% GelMA-3DF-LH组的可行细胞密度显著高于5%和15% GelMA配方组，所有组观察到的死细胞最少。CCK-8定量分析 corroborated 这些发现，显示在第7天，10% GelMA组的细胞活力优于5%和15%组（p < 0.05）。10% GelMA配方的这种优越性源于其平衡的多孔结构和力学性能：与表现出过度交联、孔隙率降低和压缩模量过高（损害细胞活力）的15% GelMA不同，也与表现出次优机械强度、不完全聚合产生的 elevated 残留细胞毒性单体、以及加速降解压倒细胞清除能力导致微环境失衡的5% GelMA不同，10% GelMA为细胞活力提供了有利条件。因此，选择10% GelMA浓度作为后续实验的最佳配方。为了进一步验证生物相容性，进行了CCK-8 assay以评估对照组、3DF、3DF-H和3DF-LH组的细胞活力。所有样品从第1天到第7天显示细胞活力无显著差异，这进一步表明3DF-LH在体外对NIH/3T3细胞无细胞毒性。

血液相容性是生物材料安全性的关键决定因素，通过标准化溶血 assay 进行评估。 Triton-X-100阳性对照组观察到严重溶血，上清液颜色从无色变为亮红色。阴性对照（PBS）和实验组（3DF、3DF-H、3DF-LH）均表现出可忽略的溶血活性，上清液无明显颜色变化（淡黄色）。溶血定量分析证实符合国际生物医学材料标准，所有测试组的溶血率均低于5%的临界阈值。通过视觉观察和定量指标的双重验证，证实了它们在血液接触环境中的临床适用性。这些结果共同证明了对细胞增殖无细胞毒性作用，并确认了所有组良好的体外生物相容性。

2.4 体外抗粘连功效评估

定量蛋白质吸附分析揭示了两性离子SBMA修饰的浓度依赖性抗污染功效。2%和3% SBMA配方在抗污染性能上无统计学显著差异（2%: 36.14 ± 2.80 μg cm^?2 vs 3%: 34.92 ± 3.11 μg cm^?2; p = 0.32），两者均显著优于1% SBMA组（38.45 ± 5.61 μg cm^?2; 与1%组相比p < 0.001）。尽管2%和3% SBMA浓度实现了相当的蛋白质抵抗性，但最终选择2%配方用于3DF-LH合成，基于其抗污染和力学性能的最佳平衡。这种战略优化平衡了界面抗粘连能力与外科操作所需的结构完整性要求。

鉴于术后粘连是伤口愈合的潜在病理结果，其特点是手术部位纤维蛋白清除受损，导致持续的纤维蛋白基质，促进 excessive 成纤维细胞增殖和胶原沉积，最终进展为纤维化粘连，我们评估了成纤维细胞粘附。细胞骨架分析显示，NIH/3T3在3DF-LH上的粘附显著减少，其粘附细胞面积比其他组小33.41%（第1天）、35.14%（第3天）和61.33%（第7天）。活/死 assay corroborated 这些发现，显示在第7天，3DF-LH上的细胞密度（67.90 ± 7.21 cells mm^?2）显著低于对照组（313.15 ± 21.31 cells mm^?2）（p < 0.05）。我们的体外研究表明，3DF-LH通过稳定两性离子水合润滑机制增强了抗粘连功效，导致成纤维细胞粘附和增殖的显著减少。

2.5 体内抗细菌粘附功效

在腹部手术期间，细菌粘附到手术伤口表面可能导致生物膜形成，引发局部感染。同时，细菌可以分泌细胞外聚合物（EPS）基质，促进纤维蛋白沉积和成纤维细胞增殖，直接加剧组织粘连。因此，我们还评估了3DF-LH的抗细菌粘附和杀菌特性。通过将水凝胶与金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）孵育1小时，分别评估了水凝胶对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的粘附。平板计数验证了3DF-LH优异的抗菌效果。定量菌落形成单位（CFU）计数如下：对于金黄色葡萄球菌，空白组3554.31 ± 52.00，3DF组3364.31 ± 149.35，3DF-H组3398.01 ± 190.59，3DF-LH组17.31 ± 5.44；对于大肠杆菌，空白组3242.00 ± 91.41，3DF组3179.36 ± 154.05，3DF-H组3015.07 ± 83.67，3DF-LH组33.00 ± 4.00。这些结果表明3DF-LH可能通过表面水合层防止 initial 细菌粘附。

使用活/死染色评估抗菌活性，其中活细菌显示绿色荧光，死细菌显示红色荧光。3DF-LH显示几乎 entirely 红色荧光，由两性离子基团的抗菌作用引起。使用SEM观察不同处理后细菌的微观形态。经过3DF和3DF-H处理后，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均保留了完整的细胞膜和光滑表面。相反，3DF-LH组表现出最显著的损伤和萎缩，死细菌会从表面脱落。因此，3DF-LH表现出优异的抗菌活性，高效应用于腹腔粘连的治疗。

2.6 体外和体内止血特性

优异的止血性能可以显著增强抗粘连材料对术后粘连的预防效果。首先，在肝脏模型（内脏器官中血管最丰富）中评估了3DF-LH的止血能力。一旦创建伤口，血液涌出，并浸透对照组和3DF组的整个纱布。相反，3DF-H和3DF-LH组的血液染色区域较小，其中3DF-LH在所有组中表现出 minimal 染色。此外，失血量按以下顺序排列：对照组（4.05 ± 0.23 g）> 3DF组（4.04 ± 0.15 g）> 3DF-H组（3.67 ± 0.61 g）> 3DF-LH组（1.48 ± 0.60 g）。

血液凝固指数（BCI）也用于初步评估3DF-LH的止血能力。对照组、3DF、3DF-H和3DF-LH组的定量值分别达到108.51 ± 1.43%、98.51 ± 2.90%、33.86 ± 7.4%和11.99 ± 3.18%，表明3DF-LH具有优异的血液凝固能力。

2.7 体内抗粘连功效与机制探索

为了验证3DF-LH的抗粘连功效，我们建立了大鼠盲肠-腹壁磨损模型，这是一个用于评估粘连屏障的成熟临床前系统。未治疗的大鼠作为阴性对照，使用标准化粘连评分系统在第7天和第14天系统评估所有组的术后粘连严重程度。该系统全面评估了三个关键参数：涉及的解剖区域范围、粘连的形态类型以及粘连的机械韧性。所有未经治疗的对照组在第7天都出现了严重粘连（平均评分：3.44 ± 0.38），证实了模型诱导成功。虽然Interceed、3DF和3DF-H组显示出有限的效果（无评分 < 2），但3DF-LH显著减少了粘连形成（平均评分：0.47 ± 0.20 vs 对照组，p < 0.001），在67%的病例中观察到完全预防。植入后14天，对照组、3DF和3DF-H组的大鼠表现出加剧的粘连形成， evidenced by elevated 平均粘连评分。同时，Interceed显示出疗效，粘连评分降至1.41 ± 0.20。形成鲜明对比的是，3DF-LH队列中的三只大鼠没有 macroscopic 粘连（评分：0）。对照组、Interceed和3DF-LH组之间的 pairwise 比较显示粘连评分存在统计学显著差异（所有配对P < 0.01）。实验结果表明，纯PCL框架 inherently 缺乏抗粘连特性。相反，整合了GelMA和SBMA的复合支架系统表现出 remarkable 的治疗效果 against 术后粘连，甚至超过了商业产品Interceed。这种仿生复合结构遵循类似于建筑中钢-混凝土协同作用的增强原理——GelMA建立了一个模拟ECM的生物活性界面以促进细胞相互作用，而SBMA通过其电荷平衡的水合层创建了一个两性离子抗污染屏障。它们的协同相互作用显著减少了蛋白质吸附和 subsequent 成纤维细胞附着，从而通过仿生整合和分子水平排斥机制有效减轻了组织粘连风险。

H&E和Masson染色图像揭示了不同的组织反应。未经治疗的对照组在第7天表现出致密的纤维化粘连和 disorganized 胶原沉积，在第14天进展为血管化、富含胶原的病变。用商业屏障Interceed治疗的动物表现出 moderate 改善，其特征是在两个时间点纤维化减少和部分胶原组织。相反，用3DF-LH治疗的大鼠在第7天显示 minimal 结缔组织，在第14天显示 near-complete 间皮再生，表明 active 组织修复。在植入后14天收获的代表性重要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏）和手术缝合部位组织的组织病理学检查证实了系统生物相容性，揭示了完整的组织结构，没有坏死、炎症或纤维化的证据。这些发现得到了全面的血液学分析（全血细胞计数）和血清生化标志物（ALT、AST、BUN、Crea）的 corroborated，所有值均在正常生理范围内，表明肝肾功能 intact。

在腹壁和盲肠创伤的早期阶段，包括巨噬细胞在内的免疫细胞浸润伤口部位并释放炎症因子。这种炎症微环境 constantly disrupts 纤溶系统的稳态，最终导致粘连形成。研究表明，TGF-β1作为组织纤维化病变最重要的触发因素之一，可以刺激腹膜间皮细胞分泌胶原和基质蛋白降解酶抑制剂。因此，我们使用免疫荧光染色定量评估体内炎症细胞因子，包括IL-6、TGF-β1和P-Smad2/3。定量分析结果显示，对照组在粘连区及周围区域表现出显著更高的IL-6、TGF-β1和p-Smad2/3表达水平。然而，3DF、3DF-H、Interceed和3DF-LH组均显示相对较低的荧光强度，其中3DF-LH组的荧光表达水平最低。结果表明3DF-LH可以显著抑制TGF-β1、IL-6和p-Smad2/3的表达。

Smad2和Smad3作为TGF-β1激活信号 cascade 的经典下游效应器。在配体诱导的磷酸化后，这些Smad蛋白与Smad4异源二聚化形成转录复合物，这些复合物易位到细胞核，通过序列特异性DNA结合和染色质重塑直接调节纤维化基因表达。值得注意的是，Smad7作为该通路的 potent 负调节因子，通过竞争性抑制Smad2/3-Smad4异源复合物的形成，从而阻断核转位和 subsequent 促纤维化靶标的转录激活。Smad2/3的磷酸化水平与纤维化进展严重程度直接相关。病理性胶原沉积——主要由I型（COL1A1）和III型（COL3A1）胶原亚型介导——构成粘连形成期间细胞外基质（ECM）重塑的一个标志，其中 elevated 胶原含量与粘连严重程度直接相关。为了机制上验证纤维化通路的转录调控，进行了定量实时PCR（qRT-PCR）以量化实验组中Smad7、COL1A1和COL3A1的mRNA转录水平。与对照组、3DF和3DF-H组相比，Interceed和3DF-LH组中COL1A1和COL3A1的表达显著降低，其中3DF-LH组的减少最为 pronounced。与对照组、3DF、3DF-H和Interceed组相比，3DF-LH组中Smad7的表达显著 pronounced。结果表明3DF-LH通过调节TGF-β1/Smad信号通路的磷酸化和减少胶原的形成来抑制腹腔粘连。

3 结论

本工作中，受混凝土的框架增强结构和建造过程启发，我们开发了一种具有适当机械强度和润滑性能的3D打印PCL框架/PSBMA水凝胶复合贴片，有效解决了PSBMA水凝胶在术后粘连预防应用中的脆弱问题。加入3D打印框架后，3DF-LH的断裂伸长率从27.34 ± 6.31%增加到205.14 ± 3.23%，其拉伸强度从0.07 ± 0.01提高到4.43 ± 0.14 MPa。这些增强的力学性能使两性离子水凝胶在外科手术过程中能够安全缝合，防止因机械弱点破裂，并提供可靠的屏障功能。此外，3DF-LH在通过 potent 抑制TGF-β/Smad信号通路减轻炎症微环境方面优于商业产品Interceed，从而更有效地抑制粘连形成。值得注意的是，3DF-LH表现出优异的生物相容性。我们的研究提出了一种有效的、受混凝土启发的减少术后粘连的策略，突出了其临床转化的巨大潜力。

4 实验部分

（此部分详细描述了材料、细胞、动物、3D打印框架的制造、复合框架的构建、材料表征、化学表征、拉伸测试、压缩测试、溶胀行为评估、水蒸气透过测试、氧渗透系数测量、降解分析、抗菌活性测试、活/死染色、细菌形态表征、大鼠肝脏体内止血能力、血液凝固指数、细胞相容性、血液相容性、抗细胞粘附评估、抗蛋白质吸附 assay、生物力学模拟测试、体内抗粘连评估、结果测量、体内生物安全性评估和统计分析所使用的方法和程序。所有程序均按照相关指南和规定进行，以确保结果的科学性和可靠性。）