胆红素通过Gas6-Axl-SOCS3信号轴增强抗炎效应缓解脊髓损伤的作用机制研究

本研究揭示了胆红素通过激活Gas6-Axl信号通路，上调SOCS3表达，显著抑制脊髓损伤（SCI）后小胶质细胞介导的神经炎症（IL-1β、MMP-9等），改善运动功能恢复。该发现为靶向TAM受体家族（Tyro3/Axl/Mer）治疗SCI提供了新策略，凸显胆红素作为临床治疗药物的转化潜力。

　　

引言

脊髓损伤（SCI）是一种破坏性的神经系统疾病，通常导致永久性功能障碍并显著降低患者生活质量。当前治疗主要依赖外科干预，包括脊柱复位、稳定和神经结构减压，旨在预防继发性损伤但恢复神经功能的能力有限。在急性期，有时使用甲基强的松龙来减轻炎症，但其临床效益因疗效不一致和潜在不良反应而存在争议。这些局限性突出了SCI管理中的一个关键未满足需求：现有方法针对结构稳定和短期神经保护，但未能针对驱动长期残疾的潜在病理级联反应，包括慢性神经炎症、氧化应激和进行性神经变性。因此，迫切需要能够调节这些基本机制并促进有意义的神经恢复的新药理学策略。

SCI由于原发性机械损伤和继发性损伤过程导致深刻的神经功能缺损。小胶质细胞介导的神经炎症是继发性损伤的主要贡献者之一，在组织损伤进展和阻碍恢复中起关键作用。最初，小胶质细胞激活起保护作用，促进细胞碎片的清除并预防额外损伤。然而，延长或过度激活可使这种反应转变为慢性炎症，加剧神经元损伤并阻碍组织修复。因此，旨在抑制小胶质细胞激活和减轻随后炎症反应的策略被认为对增强SCI恢复至关重要。

生长停滞特异性6-Axl受体酪氨酸激酶（Gas6-Axl）信号通路已成为各种损伤模型中炎症、细胞存活和组织修复的关键调节因子。最近的研究强调了其在减少神经炎症和促进损伤后组织再生中的作用，使其成为SCI治疗的有希望靶点。鉴于其在炎症调节和神经保护中的参与，Gas6-Axl通路代表了一个引人注目的SCI治疗靶点，旨在增强其信号传导的策略可能提供一种减少神经炎症和促进SCI后功能恢复的新方法。

胆红素是血红蛋白的降解产物，历史上主要被视为有害代谢副产物。然而，最近的证据强调了其有效的抗氧化、抗炎和神经保护特性。作为内源性抗氧化剂，胆红素清除自由基，从而减少氧化应激诱导的神经元损伤。此外，胆红素通过抑制促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6））的释放来抑制炎症反应，从而保持神经元完整性。尽管有这些有希望的效果，胆红素抗炎作用的确切分子机制仍不清楚。

鉴于缺乏有效的SCI药理学干预措施以及胆红素调节炎症和氧化应激的潜力，本研究旨在探索胆红素是否可以通过Gas6-Axl信号通路增强其抗炎作用，最终改善SCI恢复结果。通过研究胆红素在增强Gas6-Axl信号传导中的潜在作用，本研究旨在填补SCI治疗学的关键空白，为未来针对炎症和神经保护的药理学策略提供基础。

材料与方法

2.1 动物与处理

八周龄雌性C57BL/6J小鼠（18-22克）购自中国南京医科大学实验动物中心。小鼠在标准饲养条件下保持，包括22°C±2°C的控制环境、12小时光/暗循环和55%±5%的相对湿度。实验方案经机构动物护理和使用委员会（IACUC-2211021）批准，并按照动物研究伦理指南进行。

2.2 SCI诱导和胆红素处理

使用先前描述的挫伤模型诱导SCI。成年雌性小鼠通过腹腔注射1%（w/v）戊巴比妥钠（50毫克/千克）麻醉，并进行T9椎板切除术以暴露脊髓。使用Allen撞击装置（RWD，中国）产生损伤，该装置提供60千达因的控制力以确保一致严重性。在假手术对照组中，仅进行椎板切除术程序。损伤后，胆红素通过口服灌胃以30毫克/千克的剂量每隔一天在5周期间给药，从损伤后立即开始。所有动物在整个研究过程中密切监测痛苦和恢复迹象。通过控制撞击器的力和深度标准化损伤严重性，实验确保所有组的一致损伤诱导。

2.3 行为测试

使用Basso小鼠量表（BMS）测试和步态分析评估运动功能恢复。BMS开放场测试和自动步态分析遵循先前SCI研究的标准化协议。行为测试在SCI后7、14、21、28和35天由两名盲法实验者进行。BMS测试在1米×1米开放场中进行，所有小鼠在正式评估前适应测试环境。BMS评分系统范围从0到9，较高分数表示SCI小鼠更好的运动功能恢复。后肢运动功能在35 dpi使用CatWalk步态分析系统评估。所有小鼠执行记录至少三个连续行走周期。为防止步态分析期间外部光干扰，实验在黑暗环境中进行以确保清晰的脚印记录。步态参数使用WalkAnalysator软件自动分析，随后进行手动逐帧检查和校正以保证结果准确性。

2.4 H-反射和EMG

使用肌电诱发电位系统（海神，上海，中国）评估SCI手术后35天的H-反射和肌电（EMG）活动。对于H-反射评估，刺激电极插入坐骨神经出口，记录电极放置在腓肠肌中。对于EMG记录，刺激电极插入肌肉上的皮肤，记录电极插入腓肠肌肌腹。参考电极放置在肌腱或附近非肌肉区域，接地电极插入尾部。记录自愿运动和被动刺激期间的EMG活动，并处理信号进行分析。

2.5 Western Blotting

脊髓组织（T9-T11）在RIPA裂解缓冲液中匀浆，裂解物在4°C以12,000 g离心15分钟收集上清液。使用BCA测定测量蛋白质浓度。蛋白质通过8%-12% SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜（Millipore，美国）。膜在室温下用5%牛奶封闭2小时，随后在4°C与一抗孵育过夜。一抗包括Gas6（1:1000, A8545, ABclonal）、p-Axl（1:1000, 44463s, Cell Signaling Technology）、Axl（1:1000, A22378; ABclonal）、SOCS3（1:1000, A21981; ABclonal）、MMP-9（1:1000, 10375-2-AP; Proteintech）和IL-1β（1:1000, I3767; Sigma-Aldrich）。TBST洗涤后，膜用辣根过氧化物酶偶联二抗在室温下处理2小时。使用增强化学发光检测蛋白质条带，其强度用Image J软件量化。

2.6 细胞培养与处理

BV-2小胶质细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中培养，补充10%（v/v）胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素（KeyGEN，中国）。细胞在37°C含5% CO₂的湿润气氛中维持。对于处理，细胞与各种浓度胆红素（0.1、1和10 μM）孵育12小时以评估对Gas6和p-Axl表达的剂量依赖效应。为评估Axl抑制对胆红素诱导SOCS3表达的影响，Axl抑制剂R428（Selleckchem, S7286）在胆红素处理前1小时以1 μM浓度添加到培养物中。处理后，收集细胞用于进一步分析。

2.7 免疫荧光和成像

收集T8-T10脊髓组织并在4%多聚甲醛中进一步固定24小时。脊髓组织石蜡包埋并切成5微米切片。脱石蜡和再水化后，切片进行免疫组织化学。简要地，切片在室温下用含10%驴血清白蛋白和0.3% Triton X-100的PBS封闭1小时，随后用PBS洗涤并在4°C与一抗孵育过夜。使用以下一抗，Iba1。随后，切片在室温下与二抗孵育2小时。最后，切片用Zeiss LSM800共聚焦显微镜拍照，图像用Zeiss获取和处理。

2.8 统计分析

使用GraphPad Prism版本9.0（GraphPad Software Inc., 美国）进行统计分析。实验数据显示为平均值±SEMs。数据分析中未排除数据。通过Shapiro-Wilk正态性检验确定数据的正态分布。对于统计比较，Student's t检验（两组之间）、单因素ANOVA（多组之间）与Tukey检验（等方差）或双因素ANOVA与Tukey检验（多变量之间）用于比较正态分布变量。p < 0.05认为显著。

结果

3.1 胆红素处理改善小鼠SCI后运动功能

首先，我们研究了胆红素对SCI小鼠模型的影响。使用BMS评估SCI后5周期间后肢运动功能恢复。胆红素处理导致运动功能显著增强，早在损伤后第二周与SCI组相比即可观察到。这种改善持续并在5周观察期间逐渐增加。此外，小鼠后肢屈曲状态在胆红素处理后显著改善。

为进一步评估运动恢复，使用CatWalk系统进行步态分析。代表性脚印强度图像和步态模式证明SCI小鼠表现出 disrupted 行走行为，与假组相比脚印面积更小且不一致。相反，胆红素处理小鼠显示显著改善的步态模式，脚印更大更稳定，表明后肢运动功能更好恢复。此外，时间视图图（反映步态周期中每个肢体地面接触的时间序列和持续时间）进一步说明胆红素处理后步态协调的改善。SCI小鼠显示不规则和缩短的站立阶段，而胆红素处理小鼠显示所有四个肢体（LF、RF、LH、RH）之间更同步和延长的接触时间，表明步态稳定性和协调性增强。更重要的是，步态参数分析显示胆红素处理显著改善参数与SCI组相比，包括脚印面积、平均强度、占空比、速度、步长和站立持续时间。

此外，胆红素处理显著增加SCI+BIL组肌电（EMG）振幅，表明改善神经肌肉功能。类似地，H-反射测量显示SCI组减少振幅和Hmax/Mmax比，两者均被胆红素处理显著改善。这表明反射通路部分恢复。

3.2 胆红素通过增加SOCS3表达缓解SCI

小胶质细胞驱动的神经炎症在SCI病理生理学中关键，贡献继发性损伤和恶化神经功能障碍。SCI后，激活的小胶质细胞释放促炎因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和环氧合酶-2（COX-2）。这些介质放大局部炎症并促进神经元细胞死亡。此外，激活的小胶质细胞扰乱脊髓中基质金属蛋白酶（MMPs）平衡，导致细胞外基质降解和血脊髓屏障（BSCB）破坏，贡献组织损伤和水肿。在我们的研究中，我们观察到SCI动物损伤中心200微米内明显小胶质细胞激活和积累，如Iba1阳性细胞显著增加与假对照组相比。这些激活的小胶质细胞表现特征形态改变，包括细胞体肥大和过程缩回。重要的是，胆红素处理显著减少Iba1阳性小胶质细胞密度。此外，胆红素处理降低IL-1β、IL-6、TNF-α和MMP-9表达，表明炎症信号通路抑制。

我们通过关注SOCS3（细胞因子信号传导和炎症的关键调节因子）研究胆红素效应的分子机制。SOCS3通过抑制促炎信号通路调节免疫反应。我们的研究显示胆红素处理显著增加损伤脊髓中SOCS3表达，表明其抗炎效应部分通过SOCS3上调介导。这些结果强调胆红素作为治疗剂减少神经炎症和增强SCI后恢复的潜力，可能通过SOCS3信号传导和小胶质细胞激活调节。

3.3 胆红素通过激活Gas6/Axl信号通路诱导SOCS3表达 In Vitro

先前研究表明Axl受体可响应TAM配体如Gas6激活，随后诱导SOCS3蛋白表达。为研究此，测量用各种浓度胆红素（0.1、1和10 μM）处理12小时后BV-2细胞上清液中Gas6水平。结果显示胆红素处理后12小时BV-2细胞中Gas6表达显著增加。此外，胆红素在体外条件下促进Axl受体激活和上调SOCS3表达。

此外，我们的发现显示用外源重组Gas6蛋白（rGas6, 500 ng/mL）处理2小时显著激活Axl受体并增强BV-2细胞中SOCS3蛋白表达。然而，当细胞用Axl抑制剂R428（1 μM）预处理时这些效应被废除，表明胆红素诱导SOCS3表达依赖Axl受体激活。

3.4 Gas6基因消融消除胆红素对SCI的治疗效果

如图所示，小鼠在SCI手术后6、12和24小时用胆红素处理。Western blot分析显示胆红素在短时间内显著增加脊髓中Gas6水平。进一步研究表明胆红素不仅提高Gas6水平而且诱导小鼠SCI后35天脊髓中Axl激活。

更重要的是，我们还发现敲除Gas6基因可以取消胆红素在小鼠中的治疗效果。例如，Gas6^-/- + SCI + BIL组显示显著更高死亡率和更低BMS评分与WT + SCI + BIL组相比。使用CatWalk系统进行的步态分析证实这些发现。WT + SCI + BIL组小鼠显示步态参数显著增强，包括平均强度、脚印面积、占空比、速度、站立时间、步周期、摆动速度和步长。然而，在Gas6^-/- + SCI + BIL组中，胆红素未能产生这些步态参数的 comparable 改善，表明Gas6对于胆红素在SCI中步态和运动协调有益影响至关重要。此外，EMG分析证明胆红素处理显著增加EMG振幅；然而，这种效应在Gas6^-/- + SCI + BIL组中显著减弱。总之，这些结果强调Gas6在介导胆红素对SCI神经保护和功能恢复效应中的关键作用，表明Gas6是胆红素抗炎和运动恢复机制不可或缺的组成部分。

为进一步确认Gas6在SCI中的重要性，我们进行了以下实验。我们将损伤强度从60千达因降低到40千达因。结果显示，尽管损伤强度降低，Gas6^-/-小鼠未显示任何显著恢复。相反，WT小鼠在这种较低强度损伤下显示显著恢复。首先，生存分析显示Gas6^-/-小鼠在SCI后与WT小鼠相比显示显著更高死亡率。WT组显示100%生存；Gas6^-/-组在5周观察期间经历显著下降，生存率75%。此外，Gas6^-/-小鼠显示更低BMS评分。代表性脚印和步态模式显示Gas6^-/-小鼠有异常步态模式，脚印面积减少和行走模式不规则与WT小鼠相比。这些发现得到各种步态参数量化的进一步支持。Gas6^-/-小鼠显示显著更短站立时间、减少脚印面积和更低平均强度与WT小鼠相比。此外，摆动速度、步长、步周期、占空比和整体速度在Gas6^-/-小鼠中显著受损。此外，EMG分析证明Gas6^-/-小鼠显著减少EMG振幅。

讨论

本研究证明胆红素，一种长期被视为血红素分解代谢废物的代谢物，在SCI背景下表现显著神经保护和抗炎特性。我们的发现揭示胆红素给药改善SCI小鼠运动功能，这种效应与SOCS3表达上调密切相关。此外，胆红素通过激活Gas6/Axl–SOCS3信号通路缓解神经炎症，提供其治疗潜力的新机制见解。TAM受体家族（Tyro3、Axl和Mer），特别是Gas6/Axl轴，在各种神经系统条件中起关键神经保护作用。在阿尔茨海默病模型中，该通路已显示减轻Aβ诱导神经毒性和减少tau过度磷酸化，而在我们的SCI模型中它通过SOCS3诱导介导胆红素抗炎效应，SOCS3是促炎通路的关键抑制因子。这些结果与胆红素作为神经系统疾病中内源性抗氧化剂和免疫调节剂的作用日益认可一致，其中它已显示减轻从中风到神经退行性疾病条件的氧化应激和炎症反应。

胆红素的抗炎效应似乎通过Gas6/Axl-SOCS3信号轴介导。TAM受体家族（Tyro3、Axl和Mer）在efferocytosis和免疫反应调节中起关键作用，通过防止过度炎症帮助维持组织稳态。SOCS3，TAM受体信号的下游介质，对于抑制促炎通路至关重要。我们的研究显示胆红素显著上调Gas6和Axl表达，导致SOCS3诱导。值得注意的是，Gas6缺乏或Axl抑制废除胆红素治疗效应，确认其神经保护作用依赖Gas6/Axl/SOCS3通路。尽管我们的焦点是小胶质细胞Gas6/Axl/SOCS3信号传导，我们承认系统性Gas6敲除可能影响SCI病理生理中涉及的其他细胞类型（例如内皮细胞、巨噬细胞）。因此，观察到的表型可能反映多种细胞谱系的贡献。未来研究使用细胞特异性敲除模型将帮助剖析这些作用。

尽管这些有希望的发现，翻译胆红素为基础疗法用于SCI面临相当大挑战。该化合物在升高浓度时well-established神经毒性，如核黄疸所见，需要仔细优化给药方案和递送方法以最大化治疗益处同时最小化系统性暴露。未来研究应优先开发靶向脊髓递送系统以避免其他器官如肝脏和大脑中潜在脱靶效应。此外，尽管我们的研究确立Gas6在急性SCI恢复中的功能意义，几个重要问题仍未解答。5周观察期，虽然足以捕获关键急性和亚急性过程，排除关于慢性病理学的明确结论。延长超过12周的长期研究对于评估胶质瘢痕成熟和持续功能结果至关重要。此外，尽管我们在小胶质细胞系中鉴定Gas6/Axl/SOCS3通路，使用技术如FACS分选脊髓小胶质细胞或小胶质细胞特异性免疫荧光的体内验证对于确认细胞类型特异性信号机制关键。也许最重要的是，胆红素和Gas6/Axl系统之间的精确分子相互作用仍有待充分阐明。需要互补方法包括共免疫沉淀、表面等离子体共振和结构生物学研究以确定胆红素是否直接结合Gas6/Axl或通过间接机制调节该通路。

总之，我们的工作提供第一个证据胆红素通过激活Gas6/Axl-SOCS3信号轴在SCI中发挥神经保护效应，导致神经炎症抑制和功能恢复改善。这些发现不仅扩展我们对胆红素生理作用 beyond 其传统分类作为代谢副产品的理解，而且为调节SCI中神经炎症反应识别一个新治疗靶点。尽管显著翻译障碍仍然，本研究为未来研究奠定重要基础，旨在利用胆红素治疗潜力同时克服其临床应用的固有局限性。