探索多发性硬化相关嗅觉障碍中的鼻腔结构-微生物相互作用：一项揭示微生物组与上鼻甲体积关联的创新研究

本综述深入探讨了多发性硬化（MS）患者中常见的嗅觉功能障碍，首次揭示了其与鼻腔微生物组（如Prevotella buccalis）及上鼻甲体积的关联。研究通过UPSIT嗅觉测试、16S rRNA测序和MRI影像分析，发现MS患者存在微生物群落失调和嗅通路结构-功能解离现象，为理解MS的病理机制提供了新的微生物-结构互作视角。

　　

ABSTRACT

背景

多发性硬化（MS）患者中普遍存在嗅觉功能障碍，但其机制尚未明确。本研究首次探讨MS患者中嗅觉功能、鼻腔微生物组组成和上鼻甲体积之间的潜在关联。

方法

这项单中心观察性研究纳入42例中国MS患者和37例健康对照（HC）。采用宾夕法尼亚大学嗅觉识别测试（UPSIT）评估嗅觉功能，通过深度鼻腔微生物组分析和基于MRI的上鼻甲体积测量进行多维度研究。

结果

在UPSIT评分较低的MS患者中观察到Prevotella buccalis（P. buccalis）的相对丰度降低（p=0.030）。健康对照组中UPSIT评分与上鼻甲体积呈正相关（R_p=0.329, p=0.041），而MS组中无此相关性（R_s=-0.022, p=0.625），表明MS中存在嗅觉性能与鼻甲形态学的解离现象。此外，MS患者的上鼻甲体积与Cupriavidus、Methylobacterium-Methylorubrum、Ideonella和Acinetobacter等多个菌属呈负相关（均p<0.05），提示黏膜结构与微生物组成间存在潜在关联。

讨论

这些初步发现表明鼻腔微生物组的改变可能与MS患者的嗅觉障碍和黏膜结构变化相关。虽然P. buccalis作为嗅觉功能障碍的潜在微生物标志物出现，但其具体作用仍不明确，可能反映了继发性生态变化。需要更大规模的机制研究来确定因果关系，并评估鼻腔微生物组特征在MS中的诊断或治疗价值。

1 引言

多发性硬化是一种中枢神经系统（CNS）自身免疫性疾病，在中国属于罕见病，患病率为2.99/10万。MS与嗅觉功能障碍的密切联系已在患者和动物模型中得到报道。先前研究显示MS患者嗅觉障碍发生率接近30.0%，我们的初步研究也证实了MS患者存在嗅觉功能障碍。值得注意的是，嗅觉障碍可作为MS复发的预测指标，具有重要的症状前指示意义。

气味分子通过鼻腔黏膜中的嗅觉神经细胞传递至嗅球，经过初步处理后通过嗅束、嗅三角和前嗅核投射到皮层。虽然已有研究通过测量MS患者嗅球体积来探讨嗅觉障碍的神经萎缩机制，但结果存在争议。上鼻甲区域是嗅觉神经上皮的延伸部位，其功能与嗅觉损伤相关，但尚未有研究报道MS患者嗅觉障碍与鼻甲体积的关系。

越来越多的证据表明嗅觉与鼻腔微生物组结构相关。由于鼻腔与大气直接相通，这条特殊的嗅觉获取和处理通路可能也成为微生物进入大脑的途径。唾液和粪便微生物组的研究已显示MS患者与健康对照间的差异，上呼吸道感染与MS复发密切相关。上呼吸道在与外界环境的气体交换中起关键作用，微生物组成对嗅觉功能有显著影响。

2 方法

2.1 标准方案批准、注册和患者同意

本研究遵循《赫尔辛基宣言》，经贵州医科大学附属医院临床伦理委员会批准（批准号：2021伦495和2023伦897）。所有参与者均签署书面知情同意书。

2.2 参与者

MS患者连续招募自贵州医科大学附属医院2021年2月至2023年3月期间的患者，符合2017年修订的McDonald诊断标准。采用扩展残疾状态量表（EDSS）评估残疾水平。健康对照为年龄和性别匹配的健康门诊患者。所有受试者均未暴露于空气污染。

2.3 嗅觉识别方法

使用宾夕法尼亚大学嗅觉识别测试（UPSIT），这是一种常用的嗅觉功能障碍定量测试方法。中文版40种气味简化UPSIT被证明是可靠的工具，采用微胶囊化嗅觉测试条。40种正确识别的气味刺激作为UPSIT评分。

2.4 生物样本采集

专家将无菌鼻拭子沿鼻腔中部轻轻插入2-3cm，旋转5-10秒确保与鼻黏膜充分接触。拭子立即置于1mL无菌盐水保存液中，-80°C保存备用。

2.5 序列分析

鼻拭子在1mL无菌盐水中涡旋2分钟，离心收集沉淀。使用515F和806R引物对扩增细菌16S rRNA基因的高变V3和V4区域，在Illumina平台上进行测序。

2.6 MRI检查

MS患者和HC在贵州医科大学附属医院接受1.5T颅脑MRI扫描。MRI方案包括增强T1加权成像序列和T2加权成像液体衰减反转恢复序列。使用ITK-SNAP软件进行手动分割和编辑后计算体积。

2.7 统计分析

使用SPSS 24.0软件和R语言进行统计分析，GraphPad Prism 8.0.2软件制作统计图。符合正态分布的连续变量采用t检验，不符合者采用非参数检验。分类变量采用卡方检验。进行Pearson和Spearman相关分析。p<0.05被认为具有统计学意义。

采用α多样性指数，使用丰富度、Chao1、Shannon和Simpson指数等指标。主坐标分析用于可视化，多变量相对保存谱主要用于计算β多样性。使用R软件分析群落组成和物种丰富度。采用线性判别分析（LDA）和LDA效应大小（LEfSe）来生成基于同质性的操作分类单元（OTU）表，从而识别每组特定的生物标志物。

3 结果

3.1 MS患者和HC的人口学和临床特征

本研究最终纳入30例MS患者和30例HC。29例MS患者诊断为复发缓解型MS，1例为继发进展型MS。17例MS患者接受疾病修饰治疗（DMTs）。两组在年龄、性别、MMSE评分或体重指数（BMI）方面无显著差异。

3.2 MS患者和HC的UPSIT评分

本研究中所有受试者均未报告嗅觉功能受损。但MS患者的UPSIT评分显著低于HC（27.87±0.57 vs. 29.93±0.70, p=0.027）。ROC分析显示UPSIT评分区分MS与HC的曲线下面积为0.662（p=0.031）。未发现UPSIT评分与MS病程、EDSS评分或复发次数相关。

3.3 微生物测序质量评估

对MS和HC组收集的鼻拭子样本进行高通量测序。每个样本的质量通过DNA提取过程进行控制，OD₂₆₀/OD₂₈₀约为1.8。测序结果中原始读数范围107,595-131,769，清洁读数范围107,370-131,498，清洁标签范围102,986-125,286。

3.4 鼻腔微生物组的α和β多样性

根据ROC分析，当UPSIT评分为28.5时区分MS和HC的敏感性和特异性最高。因此将HC分为UPSIT>28（HC>28, n=6）和UPSIT≤28（HC≤28, n=8）两个亚组；MS患者分为UPSIT>28（MS>28, n=8）和UPSIT≤28（MS≤28, n=5）两个亚组。

在纲水平上，MS≤28组的Chao指数高于MS>28组（p=0.004）。其余组间无显著差异（p>0.05）。在OTU水平上，各组间α多样性无显著差异。

关于β多样性（用于量化样本间群落组成的相似性），HC≤28和MS≤28组在OTU水平的β多样性显著不同（p=0.033）；其他组中未观察到这种差异。

3.5 HC和MS患者的鼻腔微生物组组成

在门和纲水平上，HC>28亚组的Proteobacteria丰度高于HC≤28亚组（p=0.043）。在纲水平上，HC>28亚组的Gammaproteobacteria丰度高于HC≤28亚组（p=0.043）。

在属水平上，HC>28亚组的Moraxella丰度高于HC≤28亚组（p=0.028），其他组间无显著差异。在种水平上，MS>28亚组的Prevotella buccalis（P. buccalis）丰度高于MS≤28亚组（p=0.030）。

3.6 生物标志物分析和疾病通路预测

使用LEfSe方法鉴定组间差异微生物。HC与MS组鉴定出12个显著不同的分类单元（LDA评分>2.0; p<0.05）；8个在MS组中富集，4个在HC组中富集。在MS亚组中鉴定出6个显著不同的分类单元（p<0.05）。HC>28组鉴定出4个显著不同的分类单元（p<0.05）。

基于KEGG和COG数据库的微生物功能预测分析显示，MS>28有2个特有通路（花生四烯酸代谢和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定），HC>28有1个特有通路（油菜素类固醇生物合成），HC≤28有2个特有通路（胆汁分泌和新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成）。

3.7 HC和MS患者上鼻甲体积与UPSIT评分的关联

使用ITK-SNAP对HC（n=13）和MS（n=13）的每个MRI序列平面中的上鼻甲进行手动分割。分割结构重建为3D图形，基于体素大小计算其体积。

在HC中，较高比例的HC呈现较大的鼻甲体积，但这一趋势未达到统计学意义（Fisher精确检验, p=0.286）。MS组未观察到这种趋势（p=1.000）。HC组中UPSIT评分与上鼻甲体积呈显著正相关（R_p=0.329, p=0.041）；MS组中未观察到显著相关性（R_s=-0.022, p=0.625）。

使用序贯回归分析特征微生物与上鼻甲体积的关系。MS组中观察到显著负相关（R²=0.370, p=0.026；调整后p=0.052）。

3.8 MS鼻腔微生物组与相关因素的关系

使用Spearman系数分析MS临床特征与细菌属丰富度的相关性。上鼻甲体积与Cupriavidus（R=-0.588, p=0.034）、Methylobacterium-Methylorubrum（R=-0.592, p=0.033）、Ideonella（R=-0.574, p=0.04）和Acinetobacter（R=-0.589, p=0.034）等菌属呈负相关。EDSS评分与Dolosigranulum属呈正相关（R=0.719, p=0.006）。年龄与Dolosigranulum属呈正相关（R=0.650, p=0.016）。这表明鼻甲体积与微生物组成密切相关。

4 讨论

本研究中嗅觉功能障碍发生率为38.50%，与先前研究29.3%的平均发生率一致。MS的病程、复发次数和EDSS评分与UPSIT评分无显著相关，与其他研究不一致。这些分歧可能归因于嗅觉评估方法的差异，结合不同的MS亚型。

我们的结果表明，仅基于微生物组成区分MS患者与HC具有挑战性，可能是因为纳入鼻腔微生物组分析的两组间UPSIT差异不显著。然而，微生物组分析（β-多样性）可能为MS与具有相当嗅觉损伤水平的健康对照（HC）人群的初步区分提供证据。

UPSIT评分低的MS患者可能具有改变的鼻腔微生物组。虽然这种变化的具体影响尚不清楚，但有证据表明嗅觉功能障碍与鼻腔微生物组改变之间存在潜在联系。未来的研究可以使用UPSIT等嗅觉测试来筛查可能的微生物组异常。

进一步分析显示，高UPSIT HC的Moraxella丰度高于低UPSIT对应组。Moraxella属中的几个物种，如Moraxella lincolnii，是上呼吸道的常见共生菌，可能起保护作用。虽然Moraxella catarrhalis通常与易感人群的呼吸道感染相关，但其他Moraxella物种与稳定的鼻腔微生物组和黏膜健康相关。

在不同分类水平的进一步分析揭示了所有亚组中不同嗅觉水平的微生物组组成差异，嗅觉功能较好的MS亚组中P. buccalis丰度高于嗅觉功能较差的亚组。由于先前研究支持嗅觉与MS严重程度的关联，我们认为P. buccalis可能是与MS相关的重要微生物。

Prevotella spp.是口腔中的优势微生物，可栖息于皮肤、口腔、阴道和胃肠道。然而，它们与健康和疾病的关系、在微生物组中的作用以及对宿主-微生物组串扰的贡献了解甚少。现代西方生活方式与Prevotella spp.的减少相关。

P. buccalis在西方生活方式老年人群的肠道中更丰富，男性比女性更丰富，类固醇促进其在口腔中的中生作用。Prevotella spp.，特别是P. buccalis的减少与MS风险因素密切相关。此外，Prevotella spp.可能在肠-脑轴和其他领域发挥作用。先前研究报道了这些微生物在人类CNS中的存在。此外，在动物研究中补充Prevotella spp.有助于CNS功能恢复。

P. buccalis可能与MS中的嗅觉功能相关，是一个有前景的候选驱动物种。需要更大样本量和先进网络分析的研究来阐明其作用。关于预测，结合LEfSe分析，特定微生物在不同组和亚组中富集，例如MS中最富集的微生物组是Nocardioides sp. S2 84。这可能与MS患者使用免疫抑制药物相关。

在MS亚组水平，P. buccalis和Deinococcus G82015分别在嗅觉较好和较差的患者中显著富集。目前研究缺乏关于Deinococcus G8201的信息，这可能是未来研究的方向。

在嗅觉功能相对保留的MS患者（UPSIT>28）中，两个富集通路——花生四烯酸代谢和糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定——与MS病理生理学和嗅觉具有潜在相关性。花生四烯酸代谢与嗅觉缺陷和免疫调节相关，而GPI锚定蛋白与神经炎症过程和嗅束发育相关。

在嗅觉损伤的HC（UPSIT≤28）中，鉴定出两个独特通路——胆汁分泌和新霉素、卡那霉素和庆大霉素生物合成。胆汁酸已被证明具有信号作用，可能通过肠-脑-鼻免疫影响上气道微生物生态。关于抗生素生物合成通路，我们假设它可能反映了抗生素产生鼻共生菌的丰度增加。

由于MS在中国是罕见病，单中心样本量小，可能出现假阴性结果。未来的研究应增加收集样本量，收集不同MS类型，并进行微生物学动物实验以确认特定微生物和中枢侵袭形式（易位或神经扩散）。

一些研究中，上鼻甲切除与变化无关。然而，切除后嗅觉功能可能在短期内显著降低。上鼻甲改变的嗜酸性外观与嗅觉相关。上鼻甲的结构、功能和附着组成可能与嗅觉功能障碍密切相关。

为进一步研究MS中嗅觉变化的原因，我们分析了上鼻甲体积及其与微生物的关系。与HC中嗅觉功能与上鼻甲体积呈正相关相反，MS中与嗅觉功能不相关。我们假设MS中嗅觉功能与鼻甲形态学之间的潜在解离可能与鼻腔微生物的存在相关。

因此，我们进一步分析了MS因素与微生物组成的关系，结果证实了我们的假设：在MS中，UPSIT评分与Acinetobacter、Methylobacterium-Methylorubrum、Ideonella和Cupriavidus呈负相关。

Acinetobacter物种是机会性病原体。Acinetobacter baumannii是临床中最常分离的机会性病原体之一，特别是在医院环境中。以其对多种抗生素的显著耐药性而闻名。

Methylobacterium-Methylorubrum属于Proteobacteria门。MS脑白质活检显示Proteobacteria和Actinobacteria水平升高，支持了我们发现的可靠性。

Ideonella属于Ascomycota门，这些生物与嗅觉和上鼻甲体积的直接关系尚未见报道。

Dolosigranulum属于Actinomycetes门，与MS中的年龄和EDSS评分呈正相关。虽然Dolosigranulum pigrum被认为是有益的鼻腔微生物，但也有研究表明鼻腔Dolosigranulum占用增加与认知衰退之间可能存在关系。鉴于微生物作用相互作用的复杂性，目前无法确定Dolosigranulum spp.在MS中的作用。

5 结论

我们的研究表明，与健康人相比，MS患者的嗅觉功能降低。这种损伤可能与鼻腔微生物组组成的改变有关。具体而言，在嗅觉性能较差的MS患者中观察到P. buccalis的相对丰度较低；然而，其作用仍不明确，可能反映了微环境中更广泛的变化。嗅觉功能与鼻甲形态学之间的明显解离进一步支持了微生物变化而非解剖学差异可能起促成作用的观点。这些发现突出了鼻腔黏膜微环境在嗅觉功能中的潜在重要性，特别是在MS背景下。需要更大规模的长期研究