GRN基因变异携带者的功能连接与疾病进展标志物的关联研究

本文深入探讨了GRN基因致病性变异导致额颞叶变性（FTLD）的神经机制，发现无症状携带者（asympGRN）表现为丘脑皮质功能连接过度（hyperconnectivity），且与神经丝轻链（NfL）浓度升高及灰质体积（GMV）减少相关；症状期携带者（sympGRN）则显示补体蛋白（C1q/C3b）水平与功能连接的显著关联。研究提示功能连接异常可作为预测临床前转化及追踪疾病进展的潜在生物标志物，为GRN相关治疗试验提供关键洞见。

　　

引言

由前颗粒蛋白（progranulin, GRN）基因致病性变异引起的常染色体显性遗传性额颞叶变性（frontotemporal lobar degeneration, FTLD）占所有病例的5%–10%。尽管针对GRN相关疗法的临床试验正在进行中，目前仍缺乏能够预测症状发作和追踪疾病进展的生物标志物，尤其是在无症状期和早期症状阶段。既往研究已探索了包括结构磁共振成像、静息态功能磁共振成像（task-free fMRI）及体液生物标志物在内的多种候选指标，但这些标志物在不同临床阶段中的横向关系尚不明确。

无症状遗传性额颞叶痴呆（frontotemporal dementia, FTD）变异携带者在无明显灰质体积下降的情况下，表现出内在连接网络的异常。功能连接指标在无症状期似乎比结构成像指标更为敏感。在GRN携带者中，无症状个体仅存在零星区域的低灰质体积，但在最常见的GRN临床综合征所涉及的大脑网络中表现出功能连接过度（hyperconnectivity）。特别是在无症状GRN携带者（asympGRN）中，丘脑在多个GRN综合征相关网络中显示出功能连接过度，且这种过度连接在年龄较大、更接近症状发作的携带者中更为明显，提示其可能预示着症状转化。相比之下，有症状的GRN携带者（sympGRN）表现为丘脑连接减弱，但功能连接过度是否与神经退行性指标同时出现尚不清楚。

除功能连接改变外，其他疾病进展标志物也已被识别。神经丝轻链（neurofilament light chain, NfL）作为一种与轴突损伤相关的蛋白，在症状期携带者中升高，并与症状严重程度和进展相关，还可识别出有症状转化风险的无症状携带者。补体蛋白C1q和C3b是先天免疫系统的组成部分，与GRN变异携带者的整体认知恶化相关，且在Grn基因敲除（?/?）小鼠中，其水平升高与丘脑皮质过度兴奋和强迫性理毛行为有关。散发性及遗传性行为变异型FTD（bvFTD）（包括GRN-bvFTD）患者可能出现强迫行为。此外，无症状GRN携带者在症状出现前已可检测到细微的灰质体积变化。功能连接改变与这些GRN相关疾病进展标志物之间的关系尚未被探讨。

本研究旨在通过考察49名无症状和26名有症状GRN变异携带者中功能连接与疾病进展标志物之间的横向关系，为识别预测症状发作的标志物奠定基础。具体而言，我们确定了以体素水平全脑度（voxelwise whole-brain degree, WBD）衡量的功能连接与血浆NfL浓度、脑脊液补体C1q和C3b蛋白水平、强迫症（obsessive-compulsive disorder, OCD）症状严重程度及灰质体积之间的关系。我们假设疾病进展指标将与GRN变异携带者的功能连接过度相关。

方法

参与者

研究参与者来自加州大学旧金山分校（UCSF）记忆与衰老中心、Hospital Universitario Donostia以及ARTFL/LEFFTDS纵向额颞叶变性（ALLFTD）研究。共纳入75名GRN致病性变异携带者，这些携带者 microtubule-associated protein tau（MAPT）变异和染色体9开放阅读框72（C9orf72）重复扩增检测呈阴性，且具有可用的神经影像数据。49名无症状携带者（asympGRN）临床诊断为正常，且临床痴呆评定量表（CDR）加上国家阿尔茨海默病协调中心（NACC）FTLD模块行为与语言领域（CDR plus NACC FTLD）的全球评分为0。26名有症状携带者（sympGRN）包括7名轻度认知障碍、1名情绪障碍且CDR plus NACC FTLD全球评分为0.5、5名阿尔茨海默型痴呆、9名bvFTD、1名帕金森病、1名非特异性原发性进行性失语（PPA）、1名非流利型变异PPA和1名语义型变异PPA。所有sympGRN的CDR plus NACC FTLD全球评分均≥0.5，除一名帕金森病患者的评分为0。

研究还纳入71名健康对照（HC），包括GRN、MAPT和C9orf72家族的非携带者成员及无关对照，以确保年龄分布与携带者队列匹配。所有HC的简易精神状态检查（MMSE）评分≥27，或蒙特利尔认知评估（MoCA）相应评分≥21，CDR plus NACC FTLD全球评分为0，且无显著白质病变或神经系统疾病史。

血浆NfL、脑脊液补体和耶鲁-布朗强迫症量表（YBOCS）数据可用于部分asympGRN、sympGRN和HC。由于携带者组间存在年龄差异，针对每个生物标志物和神经影像测量关联分析，分别匹配了年龄、性别和利手不同的HC组。样本量因生物标志物而异：NfL分析包括asympGRN（30名）、匹配HC（47名）、sympGRN（13名）及匹配HC（33名）；补体分析包括asympGRN（17名）、匹配HC（20名）、sympGRN（13名）及匹配HC（13名）；YBOCS分析包括asympGRN（11名）、sympGRN（9名）和HC（12名）。

血浆NfL浓度使用Quanterix的Simoa NF-light Advantage Kit在HD-X分析仪上测定。脑脊液补体C1q和C3b水平通过ELISA测定。本研究经机构审查委员会批准，所有参与者或其代理人提供了知情同意。

影像采集与预处理

每位参与者接受了T1加权结构MRI扫描和T2*加权回波平面成像tf-fMRI扫描。影像数据在各站点的3T扫描仪上采集。

结构基于体素的形态测量学（VBM）预处理使用SPM12进行。T1加权图像经过空间标准化、分割为灰质和白质图像，灰质体积（GMV）图像使用8 mm全宽半高（FWHM）各向同性高斯核平滑。

功能MRI（fMRI）数据使用fMRIPrep进行预处理，包括强度非均匀性校正、颅骨剥离、分割和非线性配准至MNI空间。功能数据经过头动校正、 susceptibility distortion校正、平滑（6 mm FWHM高斯核）和去噪（非侵略性ICA-AROMA），最后进行线性去趋势、带通滤波（0.008–0.08 Hz）和 nuisance回归（Friston 24头动参数、平均白质和脑脊液信号）。头动过大（平均帧间位移>0.5 mm或有效数据时长<4分钟）的参与者被排除。

全脑度（whole-brain degree, WBD）中心性作为图论指标，用于评估功能连接，计算每个体素与大脑中其他所有体素的偏相关系数（控制 nuisance参数）之和。

为消除站点和扫描仪引起的批次效应，同时保留年龄、性别、教育年限和利手等生物变异，采用定制化ComBat方法对个体参与者的GMV和WBD图进行协调化处理。ComBat参数基于111名健康对照估计，并用于协调研究队列数据。

统计分析

生物标志物水平

通过回归分析比较asympGRN、sympGRN和HC之间的流体生物标志物（NfL、C1q、C3b），控制年龄和性别。偏相关分析（控制年龄和性别）评估所有GRN携带者及sympGRN内生物标志物与症状严重程度（CDR plus NACC-FTLD Sum of Boxes评分）的关系。NfL经对数转换，处理实验室作为 nuisance协变量。由于YBOCS数据有限（asympGRN: N=11, sympGRN: N=9），比较所有GRN携带者与HC的YBOCS总分，并评估其与CDR plus NACC-FTLD-SB评分的相关性。

统计检验使用卡方检验、t检验或Mann–Whitney U检验，显著性水平设定为p<0.05。

生物标志物与神经影像测量关联

使用SPM12检验各影像测量（GMV、WBD）与各生物标志物（log(NfL)、C1q、C3b、YBOCS总分、丘脑WBD[仅GMV分析]）之间的关系。分别对asympGRN和sympGRN进行体素水平相关性分析，识别GMV或WBD与各生物标志物显著相关的区域。为评估组间差异，通过生物标志物与基因状态交互分析识别携带者（asympGRN或sympGRN）与HC相比生物标志物与影像测量之间相关斜率更正或更负的体素。影像测量与YBOCS评分的关系在（1）所有携带者内及（2）所有GRN与HC的基因状态交互分析中检验。

组水平模型在SPM12中通过一般线性模型框架评估。 nuisance协变量包括年龄、性别、教育年限、利手和总颅内体积（TIV；仅GMV分析）及扫描时睁眼状态（仅WBD分析）。NfL分析中，处理实验室作为 nuisance协变量。组水平GMV图使用无阈值集群增强（TFCE）分析，统计显著性设定为p<0.05（家庭误差（FWE）校正），最小簇大小k≥10体素；WBD图使用联合高度和范围阈值p<0.05校正多重比较。

聚类分析

鉴于asympGRN中丘脑连接可能存在异质性，我们探讨了丘脑连接过度或过低模式是否与灰质萎缩模式相关。为基于丘脑连接识别asympGRN亚组，对其体素水平丘脑w-score进行K-means聚类。

w-score计算基于111名HC的WBD图进行体素水平线性回归，确定残差的标准差（以年龄、性别、教育年限、利手和睁眼状态作为 nuisance协变量）。每个受试者的体素水平w-score计算为：w = (?1)*(受试者值?基于年龄的预测值)/HC组残差标准差。w-score图可理解为去除 nuisance协变量后的z-score图。

提取每名asympGRN双侧丘脑内的体素水平WBD w-score进行K-means聚类。使用轮廓系数确定最佳聚类数，进行50次随机启动和100次最大迭代。为可视化，对相同丘脑w-score进行主成分分析，沿前两个主成分绘制K-means聚类定义的亚组。

为可视化丘脑连接模式，计算每个聚类的体素水平平均丘脑w-score，阈值设定为w≥1.96和w≤?1.96。使用卡方检验、t检验或Mann–Whitney U检验比较聚类间人口统计学和临床变量。为检验聚类间GMV差异，创建个体GMV w-score图（以年龄、性别、教育年限、利手和TIV作为 nuisance协变量），并生成每个聚类的GMV w-score频率图，以确定基线时每个体素上具有异常低GMV（w≤?1.65）的参与者百分比。

结果

NfL浓度在症状期升高并与症状严重程度相关，而补体水平在各组间相似

sympGRN的NfL浓度（中位数45.8 pg/mL [IQR 10.4–69.2]）高于asympGRN（9.70 pg/mL [7.35–14.4], p=0.003）和HC（11.7 pg/mL [8.47–15.6], p<0.001），但asympGRN与HC间无显著差异。 across all GRN carriers及 within sympGRN，较高NfL浓度与较高的CDR plus NACC-FTLD box评分相关（across GRN: β=0.12, 95% CI 0.07–0.17, p<0.001; sympGRN: β=0.13, 95% CI 0.04–0.23, p=0.01）。

控制年龄和性别后，C1q和C3b浓度在asympGRN（C1q: 279 ng/mL [235–354]; C3b: 3914 ng/mL [2812–4510]）、sympGRN（C1q: 334 ng/mL [274–439]; C3b: 5250 ng/mL [3913–5812]）和HC（C1q: 322 ng/mL [213–453]; C3b: 3873 ng/mL [3223–4439]）间无显著差异（C1q: p=0.30; C3b: p=0.10）。此外，C1q和C3b浓度与所有携带者的症状严重程度（CDR plus NACC-FTLD box评分）无关联（C1q: β=0.28, 95% CI ?13.93 to 14.47, p=0.97; C3b: β=145.01, 95% CI ?11.73 to 301.75, p=0.07），在sympGRN内也无关联。

较高NfL浓度与asympGRN的较高连接区域及sympGRN的灰质萎缩区域相关

在asympGRN中，较高NfL浓度与内侧额叶区域和脑干的较高WBD相关。与HC相比，asympGRN在广泛区域（包括双侧内侧前额皮质、前岛叶和丘脑）表现出NfL浓度与WBD之间更正相关的关系。在asympGRN中，NfL浓度与GMV无相关性或基因状态交互作用。

与asympGRN相反，sympGRN中NfL浓度与WBD无相关性或基因状态交互作用，与GMV也无相关性。但发现GMV的基因状态交互作用，与HC相比，sympGRN在广泛区域表现出NfL浓度与GMV之间更负相关的关系。

补体水平与WBD相关，但与灰质无关

在asympGRN中，较高C1q水平与内侧额叶和小脑区域的较低WBD相关，同时与HC相比，在右侧外侧额叶皮质（包括右侧额极和额下回）表现出与WBD更正相关的关系。但C3b与WBD无相关性或基因状态交互作用。此外，在asympGRN中，C1q和C3b与GMV无相关性或基因状态交互作用。

在sympGRN中，C1q与WBD无显著关联，但与HC相比，该组在左侧外侧和内侧额叶皮质及 precuneus 表现出C1q与WBD之间更正相关的关系。C3b在sympGRN中与WBD既存在相关性也存在基因状态交互作用。具体而言，较高C3b与广泛区域（包括双侧背外侧/内侧额叶和岛叶皮质及丘脑）的较高WBD相关。同样，与HC相比，sympGRN在左侧背外侧额叶、左侧外侧顶叶和双侧前丘脑表现出C3b水平与WBD之间更正相关的关系。与asympGRN类似，在sympGRN中，C1q和C3b与GMV无相关性或基因状态交互作用。

较高OCD症状与所有GRN携带者的较低功能连接区域相关

由于具有YBOCS评分的参与者数量相对较少，数据 across all GRN carriers进行分析。携带者与HC的YBOCS总分无差异（中位数5.5 [IQR 1.75–11.5] vs. 6.5 [0.75–9], p=0.97）。YBOCS总分与症状严重程度（CDR plus NACC-FTLD-SB）无相关性（ρ=0.09, 95% CI ?0.38 to 0.53, p=0.70）。

较重OCD症状（YBOCS）与双侧前和后扣带回、岛叶、颞中回、 precuneus 和尾状核的较低WBD相关。此外，与HC相比，携带者在双侧颞中回、 precuneus 和枕叶皮质，以及右侧中央前回、海马和壳核表现出OCD症状与WBD之间更负相关的关系。OCD症状严重程度在GRN携带者中与GMV无显著相关性或基因状态交互作用。

具有丘脑连接过度的asympGRN在FTD相关区域具有较低灰质体积

平均丘脑WBD在asympGRN或sympGRN中与体素水平GMV无相关性或基因状态交互作用。鉴于asympGRN在症状发作方面存在异质性，我们推测其中一部分可能存在丘脑连接过度。因此，我们探讨了不同水平的丘脑连接如何与不同的灰质萎缩模式相关。

基于49名asympGRN的体素水平丘脑w-score进行K-means聚类，根据丘脑连接识别出两个聚类：聚类1包括41名参与者，聚类2包括8名参与者。聚类2中的asympGRN比聚类1年龄更大、教育年限更少，但性别、利手、CDR plus NACC-FTLD全球或Sum of Boxes评分、MoCA评分或NfL浓度无差异。尽管聚类2的MMSE评分（中位数28 [IQR 28–29]）低于聚类1（30 [29–30], p=0.04），但这些平均评分仍属临床正常（≥27）。平均丘脑WBD连接w-score图表明，聚类1未显示丘脑连接过度或过低的体素，而聚类2表现出丘脑连接过度。

为更好地理解丘脑连接与GMV的关系，我们观察了每个聚类中显示低GMV（w≤?1.65）的参与者百分比。值得注意的是，虽然聚类1中最多34.2%的asympGRN在特定体素出现低GMV，但聚类2中的这一比例升至75%。具体而言，34.2%的聚类1 asympGRN在左颞中回体素出现低GMV，24.3%至29.3%在双侧额中回、左颞下回、右颞极、左背内侧丘脑和双侧小脑出现低GMV。在同一阈值下，75%的聚类2 asympGRN在左外侧顶叶皮质和双侧小脑体素出现低GMV，62.5%在左前岛叶、右外侧额叶皮质、右颞中回和左颞极出现低GMV，50%在右前和后岛叶、右额下回和右颞极出现低GMV。

讨论

本研究发现，在GRN-FTD的无症状期和症状期，较高的功能连接与疾病进展指标相关。较高NfL浓度与asympGRN的较高WBD相关，而在sympGRN中，较高连接与较高补体C1q和C3b水平相关，后者在Grn?/?小鼠中已知可引起异常突触修剪和丘脑皮质过度兴奋。携带者的强迫症症状严重程度与广泛的功能连接降低相关。具有较高丘脑功能连接的asympGRN也倾向于在顶叶和岛叶皮质（FTD中退化的区域）有更多GMV损失。总体而言，这些发现表明，在asympGRN中，连接过度可能预示着症状期的开始。

在asympGRN中，较高NfL浓度与较高功能连接区域的关联表明， elevated connectivity可能是早期疾病的标志。NfL浓度与 greater symptom severity相关，并可预测无症状FTD变异携带者未来临床衰退的可能性。asympGRN中NfL与功能连接（而非GMV）的关联强调了功能连接测量在检测无症状携带者改变方面比结构测量更敏感。

与对照组相比，sympGRN具有 elevated NfL浓度，且较高NfL与广泛灰质萎缩的关联更强。这一发现与既往研究一致，表明NfL在遗传性FTD（包括GRN-FTD）中异常升高并与萎缩相关。与asympGRN相反，sympGRN中NfL与功能连接无关联。NfL与萎缩的相关性表明，对于sympGRN，评估GMV可能比功能连接更优，这与结构MRI指标在区分sympGRN与对照组方面表现更佳，而功能连接过度评估在asympGRN中优于结构指标的发现一致。

在sympGRN中，较高C1q和C3b与皮质和皮质下区域（包括丘脑）的连接增加相关。这一发现与Grn?/?小鼠的研究一致，表明前颗粒蛋白缺失导致过度补体激活，进而增强小胶质细胞对丘脑抑制性神经元的修剪，导致丘脑皮质过度兴奋。因此，sympGRN中这种补体相关的连接过度为补体失调与异常功能连接提供了 compelling link。

补体蛋白与连接的关系在asympGRN中更为复杂。C1q与较低连接（相关性）和较高连接（基因状态交互作用）均相关，而C3b在asympGRN中无显著关系。一项对7名无症状携带者（4名GRN和3名C9orf72重复扩增）的研究发现，基线补体蛋白与症状发作时间无关。这表明C1q和C3b对于检测无症状期的变化并非最优，可能解释了asympGRN中C1q和C3b缺乏一致关系的原因。

我们发现较重OCD症状与较低前扣带回和右外侧枕叶体积以及 frontotemporostriatal 连接降低相关，这些区域与FTD中OCD相关萎缩重叠。FTD中的OCD症状与纹状体和外侧颞叶萎缩以及前扣带回、双侧杏仁核和海马萎缩相关。值得注意的是，bvFTD患者的OCD行为与默认模式网络连接增加相关。特定网络可能与OCD行为表现出 distinct relationships，可能与本研究采用的全脑度测量（反映区域的整体功能连接）不同。

与本研究观察到的OCD相关连接降低相反，Grn?/?小鼠表现出丘脑皮质过度兴奋。具有遗传性FTD变异的啮齿类动物表现出重复行为，在Grn?/?小鼠中，伏隔核中型多棘神经元的过度兴奋与强迫性理毛相关。值得注意的是，人类fMRI研究中的连接过度测量与Grn?/?小鼠中观察到的过度兴奋测量 different phenomena。fMRI连接过度反映了临床队列与对照组相比两个大脑区域之间BOLD信号时间一致性的增加。Grn?/?小鼠丘脑脑切片中的过度兴奋定义为与Grn+/+小鼠相比细胞外记录到的动作电位数量更多。另一种可能性是，我们的人类队列与小鼠队列的疾病阶段可能不同，影响了结果。

尽管我们的总体发现是 across all carriers的OCD相关连接降低，但这可能是由出现OCD症状的sympGRN亚组驱动。然而，由于样本量有限，我们未单独检验sympGRN中的OCD-影像关联。虽然连接过度是无症状期的一个特征，但sympGRN会出现丘脑连接降低。神经退行性疾病（如行为变异型FTD和阿尔茨海默病）在症状期表现为连接减少，通常在萎缩区域内显示连接降低模式。对于GRN，更大的数据集将澄清OCD症状严重程度在不同临床阶段携带者（例如，asympGRN为连接过度，sympGRN为连接降低）中是否与连接表现出不同的关系。

在asympGRN中，丘脑连接增加可能预示着症状发作的临近。通过聚类分析，我们基于丘脑连接识别出两个asympGRN亚组。值得注意的是，一个无症状亚组具有丘脑连接过度，而另一个则无丘脑连接异常。重要的是，具有丘脑连接过度的asympGRN亚组年龄更大，其中75%显示左外侧顶叶体积较低的区域，62.5%在左前岛叶、右外侧额叶皮质和左颞极有低GMV，这些是GRN-FTD中退化的关键区域。相比之下，缺乏丘脑连接异常的无症状亚组中仅34.2%在重叠区域有低GMV。这些发现与先前观察一致，即功能连接（包括丘脑连接）在年龄较大、更接近症状发作的asympGRN中增加。因此，较高连接可能预示着向症状期的转化。研究表明，连接过度与转化风险增加相关，并且是症状期的前兆。本研究结果表明，评估关键FTD区域内的连接过度可能识别出有症状转化风险的asympGRN，这将有助于临床试验的队列选择。

结论

本研究发现，功能连接改变与GRN-FTD各临床阶段的疾病进展标志物相关，为识别预测症状发作的生物标志物提供了基础性一步。在asympGRN中，连接过度、高NfL和低灰质体积的同时出现表明，连接过度可能预示着症状期的开始。未来需要纵向研究验证功能连接过度作为无症状携带者生物标志物的作用。在sympGRN中，连接过度与较高补体蛋白水平相关。因此，每种标志物似乎能够检测不同阶段的动态变化。

本研究的主要限制是大多数asympGRN的实际症状发作时间未知。未来研究将确认表现出较高连接的个体在多大程度上处于向症状期转化的风险中。尽管教育年限作为协变量纳入分析，但