非人灵长类组织新型腺相关病毒衣壳的系统鉴定、系统发育特征及其在基因治疗中的转化应用

本综述系统阐述了从非人灵长类（NHP）组织中鉴定新型腺相关病毒（AAV）衣壳变体的创新性研究。研究通过整合多重PCR引物与长读长测序技术，成功捕获1925种天然AAV变异体，将天然衣壳库扩大20倍以上，并重点鉴定出1274种AAV11家族代表变异体。基于共进化分析设计的工程化变体AAV11.P5V6在体外人类及NHP原代肝细胞中展现出显著增强的转导效率，并在小鼠中枢神经系统（CNS）模型中实现高效靶向。此外，该变体具备强大抗体逃逸能力，与AAV8、AAV9几乎无交叉中和反应，显示出低血清流行率和免疫逃逸优势。本研究建立了“天然发现—进化分析—功能优化”的系统框架，为开发具备临床级组织特异性、低免疫原性及跨物种兼容性的下一代AAV载体提供了新范式。

　　

引言

腺相关病毒（AAV）因其低致病性、最小程度的宿主基因组整合、可持续的转基因表达以及广泛的组织趋向性，已成为临床基因治疗的主要病毒载体。然而，其广泛应用面临几大关键挑战：人群中40%–80%存在预存中和抗体（NAb）、物种依赖的治疗差异以及次优的趋向特异性。尽管当前的AAV衣壳修饰策略（如定向进化和理性设计）推动了该领域发展，但由于对衣壳生物学机制理解不完整以及持续的转化障碍，其应用仍受限，因此亟需发现新型AAV衣壳。

材料与方法

研究从食蟹猴（Macaca fascicularis）的组织样本中系统采集了322份样本，涵盖脑、心、肝、脾、肺、肾等多个器官。通过高保真Q5聚合酶进行巢式PCR扩增，并采用PacBio SMRT测序平台对条形码编码的全长衣壳序列进行高通量长读长测序。生物信息学处理包括最大似然系统发育树构建以及非同义（dN）和同义（dS）突变率的比较分析，以区分功能性变异与测序误差。

结果

3.1 猴组织数千种天然AAV衣壳变体的分离与发现

通过多重引物对（靶向AAV1–13基因组的保守区域），从31只猴的322份组织cDNA文库中扩增出12,009条 distinct AAV VP1衣壳DNA序列。经严格过滤后，获得1925条代表真实天然突变体的全长衣壳序列，将天然衣壳库扩大了20倍以上。系统发育分析显示所有变异体均聚集于已知AAV进化枝内，未出现新的血清型。其中，1274条序列（占66.18%）被归类为AAV11衍生变体，这是迄今为止单一AAV血清型中最大的天然衣壳数据集。

3.2 基于共进化驱动方法的AAV衣壳变体工程化

衣壳蛋白序列比对揭示了突变在九个可变区的不均匀分布，提示了关键位点的趋同进化。将高频突变（发生频率>10%）定义为氨基酸替换，并分析了不同AAV变异体的组合模式。有趣的是，AAV7.P1–AAV7.P3自然进化出的S304N和K217E突变，与通过理性设计已知可恢复AAVrh48生产力的突变重合。

3.3 AAV11变体在多种肝细胞和CNS细胞系中增强转导效率

AAV11及其变体在脑和肝组织中显著富集。在Huh7人肝癌细胞系和HMC3人小胶质瘤细胞系中，AAV11.P5的转导效率比亲本AAV11高约3倍。通过两种工程策略（R系列和V系列变体）解析AAV11.P5中单个突变的功能贡献，发现携带N498D回复突变的AAV11.P5V6变体在Huh7和HMC3中的转导效率比AAV11.P5高约2倍，比野生型AAV11高7–8倍。在原代人肝细胞（ProliHH）和原代猴肝细胞（ProliMH）中，AAV11.P5V6的转导效率比AAV8高200倍以上；在CNS细胞系（HMC3和U251）中，其效率分别比AAV9高60倍和10倍以上。

3.4 AAV11.P5V6增强体内CNS转导

将携带CMV-luciferase-EGFP盒的AAV注射到成年小鼠海马区。21天后，通过免疫荧光染色定量显示，AAV11.P5V6实现了约15%的神经元转导（几乎是AAV9的两倍）。利用截短的GfaABC1D启动子驱动EGFP表达，发现AAV11.P5V6在海马区实现了超过20%的星形胶质细胞转导，显著优于AAV8、AAV9和亲本AAV11。

3.5 AAV11变体表现出显著降低的交叉反应性和增强的NAb逃逸能力

使用人静脉注射免疫球蛋白（IVIG）和两种商业人血清池进行体外中和试验。高剂量IVIG（>40 μg）可中和50%的AAV11、AAV11.P5和AAV11.P5V6转导，而低剂量IVIG（~4 μg）即可达到AAV8和AAV9的中和终点。两种血清池即使在最低稀释度下也不能中和AAV11变体，而AAV8和AAV9在1/10至1/31.6（血清池1）和1/3.16至1/10（血清池2）稀释度下被中和。体内实验表明，抗AAV8和抗AAV9血清即使在最大稀释度（1:1578）下也不能中和AAV11及其变体，而抗AAV11血清对AAV8或AAV9无交叉中和作用，但在1:1578稀释度下能有效中和AAV11、AAV11.P5和AAV11.P5V6。

讨论

作为基因治疗领域的重要载体，AAV仍面临NAb显著降低载体递送效率以及次优趋向性导致需要高剂量给药从而引发免疫反应和毒性的挑战。与实验室驱动的选择压力相比，自然进化压力使衣壳序列在功能有益位点发生趋同，从而能够通过发现、分析和工程化改造快速获得优化的AAV衣壳。本研究利用新分离的天然AAV变体广度，通过共进化引导的工程化设计了新型AAV11突变体，并证明其在体外可高效转导多种人肝细胞，在体内可高效转导小鼠CNS的神经元和胶质细胞，具备作为基因治疗递送载体的潜力。AAV11及其衍生物在体外表现出比AAV8和AAV9高≥10倍的抗体逃逸能力，且与它们几乎无交叉反应性，验证了其低血清流行率和独特的抗原性。历史上，AAV基因组表征依赖于有限引物对的PCR扩增和Sanger测序，尽管NGS增强了突变检测灵敏度，但其短读长需要计算组装全长衣壳，产生了重建伪影。第三代测术通过实现无需组装的全长衣壳序列单分子分辨率革新了这一范式，但在PCR扩增和低测序深度方面仍受限。本研究通过多重PCR引物对和高深度长读长三代测序技术，从31只NHP猴的322份组织中扩增出1925种新型AAV变异序列，尤其是大量先前未表征的AAV11变体，将作为基因治疗递送载体的天然AAV变体库扩大了20倍以上。

结论

总之，通过整合增强的天然衣壳发现流程与高深度SMRT测序策略，本研究开创了一个进化驱动的AAV发现平台，发现了数千种新型灵长类来源变体，并设计了能高效靶向人类肝细胞和小鼠CNS且具备独特抗原性（NAb逃逸能力≥10倍 vs. AAV8和AAV9）的AAV11突变体。这种进化解码策略重新定义了天然衣壳资源的利用，将生物多样性与临床载体设计相桥接，以克服免疫屏障并推动精准基因治疗。