基于合成致死策略的LIG1与PARP抑制剂联合疗法开发及其在前列腺癌治疗中的意义

本研究通过全基因组CRISPR筛选发现LIG1是前列腺癌中PARP抑制剂的合成致死新靶点。LIG1抑制剂L82-G17与奥拉帕利(olaparib)联用可在体内外协同诱导DNA损伤和凋亡，且对正常组织毒性低，为治疗去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)提供了新策略。

　　

ABSTRACT

尽管雄激素受体信号抑制剂(ARSIs)和聚(ADP-核糖)聚合酶抑制剂(PARPIs)取得进展，转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)仍然致命。PARPIs的临床疗效在同源重组修复(HRR)缺陷(如BRCA1/2突变)患者中因耐药性而受限。因此，识别与PARP的新型合成致死相互作用可扩大治疗选择并提高疗效。本研究通过在全基因组范围内对DU145、22Rv1和LNCaP前列腺癌细胞系中的18,010个基因进行CRISPR-Cas9敲除筛选，以确定影响PARPI奥拉帕利敏感性的基因。筛选发现PARP和LIG1是合成致死诱导因子，而TP53赋予对PARPIs的耐药性。同时抑制LIG1和PARP增加了DNA损伤和凋亡。此外，LIG1抑制剂L82-G17与奥拉帕利联用表现出协同效应。研究首次在体内验证了这种联合疗法，在DU145异种移植模型中抑制肿瘤生长，同时最小化对正常组织的毒性。免疫组化分析显示LIG1在CRPC组织中过表达，提示其作为治疗靶点的潜力。本研究确立LIG1为前列腺癌中新型合成致死诱导因子，表明L82-G17增强奥拉帕利疗效，且不依赖BRCA突变状态。这些发现表明PARP和LIG1抑制剂联合可能成为mCRPC的新型治疗策略。

1 Introduction

尽管有新一代雄激素受体信号抑制剂(ARSIs)和治疗进展，转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)仍然致命；DNA损伤反应(DDR)通路的变化对其侵袭性至关重要。基因组分析表明20%–30%的mCRPC患者携带DDR相关基因突变，特别是BRCA1/2、ATM、CHEK2和CDK12，这些突变与肿瘤侵袭性和耐药性增强密切相关。靶向DDR通路的这些变化是mCRPC的一种有前景的治疗方法。

在DDR靶向方法中，聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)抑制剂(PARPIs)是治疗具有同源重组修复(HRR)缺陷肿瘤的有前景的方法。通过抑制PARP1/2，PARPIs阻断单链断裂的修复，导致其积累并在HRR缺陷的肿瘤细胞中诱导合成致死。奥拉帕利和鲁卡帕利是FDA批准的PARPIs，对具有BRCA1/2突变的mCRPC患者具有临床疗效。然而，其在非BRCA DDR突变或没有HRR缺陷患者中的有效性尚不明确，使得mCRPC管理具有挑战性。由于PARPIs和ARSIs联合使用可改善CRPC患者的预后，可能存在未知的显示合成致死的基因。

PARPIs耐药通常由HRR恢复或替代修复通路等机制驱动。为解决此问题，研究了其他DDR抑制剂(如ATR或DNA-PK抑制剂)的协同作用。除了耐药管理，扩大PARPIs的适应症需要新的合成致死相互作用和分子靶点。

使用CRISPR等功能筛选可识别PARPIs增敏剂的靶点。使用sgRNA文库，针对356个DNA修复基因的CRISPR筛选发现，缺失LIG1、EMR1和FAAP224可增加PARPIs疗效。然而，这些抑制剂的体内效果尚未得到证实。

因此，本研究旨在通过针对18,010个基因的全基因组CRISPR筛选，识别前列腺癌中与PARP相关的新型合成致死基因，建立一种新型联合疗法以增强PARPIs疗效。我们将LIG1确定为与PARPI诱导合成致死的最有效靶点。我们评估了LIG1在临床前列腺癌样本(包括CRPC组织)中的表达。我们的结果表明LIG抑制剂在体内具有治疗效果。

2 Materials and Methods

2.1 Cell Culture

DU145、22Rv1和LNCaP前列腺癌细胞购自ATCC，在添加10%胎牛血清的基础培养基(DMEM用于DU145，RPMI1640用于22Rv1和LNCaP)中，于37°C、5% CO₂的湿润培养箱中维持。

2.2 Lentivirus Packaging

使用Invitrogen ViraPower Lentiviral Packaging Mix按照制造商方案进行用于基因传递的慢病毒包装。将载体质粒和ViraPower Lentiviral Packaging Mix使用Lipofectamine 2000转染到HEK293FT细胞中。24小时后更换培养基，再培养48小时。收集含有慢病毒的培养上清，于-80°C保存直至使用。

2.3 Establishment of Cas9-Stably Expressing Prostate Cancer Cell Lines

将用Lenti-Cas9 blast制备的慢病毒上清液加入DU145、22Rv1和LNCaP细胞中。24小时后更换新鲜培养基。使用博来霉素(DU145: 1.5 μg/mL, 22Rv1: 1.5 μg/mL, LNCaP: 1.5 μg/mL)进行细胞筛选。存活细胞使用有限稀释法进行克隆分离。

2.4 Cas9 Functional Assay

使用先前报道的测定法评估克隆的Cas9表达前列腺癌细胞中的Cas9功能。将针对绿色荧光蛋白(GFP)的gRNA以及由2A序列介导的蓝色荧光蛋白(BFP)和GFP的编码序列使用慢病毒载体pKLV2-U6gRNA5(gGFP)-PGKBFP2AGFP-W导入细胞。转导后培养5天，通过流式细胞术评估BFP和GFP的表达，其中BFP阳性和GFP阴性细胞的百分比决定了Cas9功能，因为GFP被敲除。作为对照，使用不表达GFP gRNA的pKLV2-U6gRNA5(Empty)-PGKBFP2AGFP-W进行相同实验，确认Cas9表达细胞也变为BFP和GFP阳性细胞。在每个前列腺癌细胞系中Cas9敲除效率最高的克隆用于CRISPR筛选。

2.5 gRNA Library

使用了由Kosuke Yusa赠送的Human Improved Genome-wide Knockout CRISPR Library v1，包含90,709个靶向18,010个基因的gRNA。

2.6 Generation of Genome-Wide Mutant Cell Pool and Screening

将3.0 × 10⁷个稳定表达Cas9的前列腺癌细胞(DU145、22Rv1和LNCaP)用多重感染(MOI)=0.3的全基因组gRNA慢病毒上清转导。转导两天后，收集部分细胞，通过流式细胞术检测gRNA转染细胞中BFP阳性的百分比为25%–35%。使用嘌呤霉素进行6天细胞筛选。通过细胞选择获得的全基因组突变细胞池用奥拉帕利和其溶剂DMSO作为对照培养14天。这些实验从1.0 × 10⁷个细胞开始，以达到每个gRNA 100个细胞，在细胞传代期间接种1.0 × 10⁷个细胞。奥拉帕利浓度为2.5 μmol/L，对亲本前列腺癌细胞增殖影响可忽略不计。培养14天后，收集存活细胞，使用DNeasy Blood and Tissue Kit从5 × 10⁶个奥拉帕利处理细胞和1.5 × 10⁷个对照未处理细胞中提取基因组DNA。每个细胞系进行三次独立的CRISPR筛选实验。

2.7 gRNA Sequencing

通过PCR在从细胞中提取的基因组DNA的gRNA区域添加用于样品区分的接头和条形码序列，使用AMPure XP kit纯化所得PCR产物。使用TapeStation High Sensitivity D1000进行序列文库质量检查。使用Illumina测序仪对基因组RNA进行测序。使用MAGeCK分析向导和基因的富集和缺失。

2.8 MTS Cell Viability Assay

将细胞接种在96孔板中(DU145: 1.5 × 10³ cells/100 μL, LNCaP: 3.0 × 10³ cells/100 μL, 22Rv1: 8.0 × 10³ cells/100 μL)并孵育24小时。添加PARPIs和溶剂至所述浓度，再培养72小时。然后加入20 μL CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent，在37°C、5% CO₂下孵育1小时。使用酶标仪在490 nm测量吸光度。

2.9 SDS-PAGE and Western Blotting

使用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞核蛋白，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。膜与指定特异性抗体孵育，然后与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠或兔免疫球蛋白二抗孵育，使用增强化学发光 western blotting检测试剂进行检测。使用ChemiDoc XRS Plus系统进行化学发光检测。使用LIG1和组蛋白H3进行免疫学分析。

2.10 Neutral Comet Assay

使用中性彗星试验评估DNA双链断裂。将2 × 10⁶个细胞接种在六孔板中，用20 μmol/L奥拉帕利或DMSO培养48小时。收集后，用PBS调整细胞至2 × 10⁶ cells/mL。将15 μL此细胞悬液与90 μL 1%低熔点琼脂糖混合，转移到OxiSelect Comet assay slide上，4°C孵育30分钟。细胞在中性缓冲液中裂解2小时，4°C，在TBE缓冲液中12 V、4 mA恒定电流电泳25分钟。用Vista Green DNA Dye染色。使用OpenComet软件分析至少50个细胞。

2.11 Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay

将转染非靶向gRNA或LIG1 gRNA的22Rv1细胞接种在六孔板中，加入DMSO或奥拉帕利(20 μM)。培养72小时后，收集细胞，用Annexin V-FITC Apoptosis Staining/Detection Kit染色，并通过流式细胞术检测。

2.12 Immunofluorescence

将DU145和22Rv1细胞接种在八室腔室载玻片上，过夜孵育。第二天进行药物处理；48小时后，用PBS洗涤细胞，4%多聚甲醛冰上固定15分钟。使用含0.1% Triton X-100的PBS在室温下透化15分钟。用于免疫染色的一抗在PBS-T中稀释，4°C孵育过夜。使用兔抗磷酸化组蛋白H2A.X单克隆抗体。洗涤后，载玻片与Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG在室温下孵育30分钟。然后用PBS-T洗涤，并用含DAPI的ProLong Gold Antifade试剂复染。使用荧光显微镜获取荧光图像。通过计算γH2AX阳性细胞(具有10个RAD51核焦点的细胞)相对于DAPI染色细胞总数的百分比来量化DNA损伤程度。

2.13 Drug Synergy Analysis

将DU145细胞接种在96孔板中，以矩阵形式用DMSO或三种剂量的奥拉帕利和L82-G17处理。5天后，进行MTS细胞活力测定。使用SynergyFinder 3.0基于HSA模型计算药物协同得分。

2.14 In Vivo Xenograft Studies

在免疫缺陷小鼠中建立人前列腺癌异种移植模型。将DU145细胞注射到5周龄雄性小鼠的右侧腹。定期使用数字卡尺监测肿瘤生长，并使用公式计算肿瘤体积。一旦肿瘤体积超过200 mm³，将小鼠随机分配到载体对照组、奥拉帕利组、L82-G17组或联合治疗组。每周两次腹腔注射载体、奥拉帕利和L82-G17。在处理后第30天或肿瘤达到最大伦理大小时处死小鼠。部分 harvested tumors 用10%中性缓冲福尔马林固定。所有动物程序经大阪大学动物研究委员会批准，并依据相关监管标准进行。

2.15 Immunofluorescence of Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Samples

对小鼠皮下肿瘤的FFPE切片使用EDTA缓冲液进行抗原修复，并在Pascal压力室中110°C加热4分钟。然后在封闭缓冲液中孵育5分钟。用于免疫染色的的一抗在DAKO Antibody Diluent中稀释，4°C孵育过夜。洗涤后，切片与相应的二抗在室温下孵育30分钟。用蒸馏水洗涤后，切片用含DAPI的ProLong Gold Antifade reagent封片，4°C保存。使用荧光显微镜获取荧光图像。通过计算γH2AX阳性细胞(具有五个RAD51核焦点的细胞)相对于DAPI染色细胞总数的百分比来量化DNA损伤程度。

2.16 TUNEL Assay of FFPE Samples

使用TUNEL assay Kit对FFPE组织切片进行TUNEL assay。组织切片脱蜡、复水，并用蛋白酶K室温处理15分钟。PBS洗涤后，切片与TUNEL反应混合物在37°C湿润 chamber 中孵育60分钟。洗涤载玻片并用DAPI复染。使用荧光显微镜检查染色切片。TUNEL阳性核量化为总DAPI染色核的百分比。

2.17 Immunohistochemical Studies

使用人标本的免疫组化染色经大阪大学伦理委员会批准。在4 μm厚石蜡包埋组织样品上进行免疫组化染色。肿瘤样品切片用EDTA缓冲液处理，并加热20分钟进行抗原活化。通过用0.3%过氧化氢孵育5分钟阻断内源性过氧化物酶活性，然后与一抗4°C过夜孵育。使用DAB底物进行染色。切片用苏木精复染。对于LIG1的免疫组化分析，在400倍视野下计数阳性细胞与肿瘤细胞的比率，并使用每个样品三个不同随机视野计算比率的平均值。

2.18 Data Analysis and Statistics

数据表示为平均值±标准误(SE)。如果数据在Shapiro–Wilk检验中服从正态分布，则使用非配对t检验进行比较；否则，使用Mann–Whitney U检验进行比较。统计学显著性设定为p < 0.05。使用JMP Pro 14软件进行分析。

3 Results

3.1 Identification of Candidate Genes Affecting PARPI Sensitivity

为识别影响前列腺癌细胞对PARPIs敏感性的基因，我们使用稳定表达Cas9的DU145、22Rv1和LNCaP前列腺癌细胞系进行了全基因组CRISPR敲除筛选。使用靶向18,010个基因的全基因组gRNA文库创建基因敲除细胞池，用奥拉帕利或DMSO培养14天。在PARPIs下存活必需的基因敲除细胞被耗尽，通过对存活细胞中gRNA进行下一代测序来识别候选合成致死基因。

总体而言，在LNCaP、22Rv1和DU145细胞中分别识别出187、204和231个负选择基因，这些基因敲除时增强了奥拉帕利敏感性；23个基因在至少两个细胞系中被识别。奥拉帕利处理下下调基因的Gene Ontology (GO)分析揭示了富集通路，如DNA修复和复制，证实了这些通路与PARP功能的相关性。这些结果表明筛选方法是稳健的。

此外，在LNCaP、22Rv1和DU145细胞中分别识别出226、224和278个正选择基因，这些基因敲除时赋予对奥拉帕利的耐药性；27个基因在至少两个细胞系中被识别。PARP1和PARP3在两个细胞系中常见，并且PARPIs主要靶点PARP1的敲除减弱了奥拉帕利的效果，支持了我们的实验系统。

3.2 LIG1 Enhances the PARPIs Efficacy in Prostate Cancer Cell Lines

作为与PARP合成致死的有前景的候选基因，我们聚焦于LIG1，其在22Rv1和DU145细胞系中奥拉帕利选择下排名前10的负选择基因之中。LIG1是DNA连接酶家族成员，对DNA复制和单链断裂修复至关重要。在几种癌症(包括乳腺、肺、结直肠和卵巢癌)中检测到LIG1表达增加。与正常前列腺和局部激素敏感性前列腺癌组织相比，我们发现LIG1在CRPC患者组织样本中过表达。此外，TP53和PARP1在LNCaP和22Rv1细胞系中与奥拉帕利耐药相关的基因中排名前10。因此，我们聚焦于TP53作为奥拉帕利耐药的有前景候选基因。

我们在22Rv1和DU145对照和PARPIs敲除细胞中验证了LIG1和TP53的功能；LIG1敲低不影响细胞增殖。用PARPIs奥拉帕利或维利帕利处理LIG1或TP53敲除细胞，并评估细胞增殖。TP53敲除不改变TP53突变细胞(DU145)的敏感性，而TP53敲除显示TP53功能细胞(22Rv1)的耐药性。LIG1敲除增强了DU145和22Rv1细胞对PARPIs的敏感性。我们假设在LIG1缺陷条件下，PARPIs诱导DNA损伤并触发细胞死亡。使用彗星试验，我们发现奥拉帕利在LIG1敲除细胞中比对照细胞增加了DNA断裂。在奥拉帕利处理的DU145细胞中，LIG1敲低组中γH2AX焦点阳性细胞的百分比高于对照组。使用Annexin V assay，我们证实奥拉帕利在LIG1敲除细胞中诱导凋亡。因此，LIG1缺陷增强了PARP抑制后的DNA损伤和凋亡，增加了前列腺癌细胞对PARPIs的敏感性。因此，LIG1是与PARP合成致死的新基因。

3.3 LIG1 Inhibition Enhances the Therapeutic Effect of PARP Inhibition Through Synergistic Cytotoxicity

我们使用有效且选择性的LIG1抑制剂L82-G17评估了LIG1和PARP抑制的组合。用奥拉帕利、L82-G17或两者处理LNCaP、22Rv1和DU145细胞。联合处理在所有细胞系中比单一处理降低了细胞活力。使用SynergyFinder通过ZIP方法计算协同得分，揭示了协同效应。

联合处理在22Rv1和DU145细胞中增强了γ-H2AX焦点形成，表明DNA损伤增加。因此，LIG1和PARP的联合抑制在前列腺癌细胞中诱导了协同效应。

3.4 Combination Therapy Demonstrates Superior Antitumor Efficacy in DU145 Xenograft Models

在DU145异种移植小鼠模型中评估了联合治疗的抗肿瘤疗效。在对照组、奥拉帕利单药治疗组、L82-G17单药治疗组和联合治疗组之间观察到体重没有差异，表明全身毒性最小。奥拉帕利和L82-G17联合使用抑制了肿瘤生长。肿瘤组织的免疫组化分析显示联合治疗组中γ-H2AX表达增加，支持DNA损伤的诱导。cleaved PARP的表达在联合组中也升高，支持凋亡的诱导。此外，TUNEL assay显示联合治疗组中DNA断裂增加，强化了DNA损伤作为关键作用机制。因此，LIG1和PARP抑制的联合在体外和体内前列腺癌模型中表现出协同细胞毒效应。

4 Discussion

PARPIs用于治疗前列腺癌；然而，其有效性受限于受益患者群体有限和反应持续时间相对较短。最近，ARSIs和PARPIs联合使用已显示有效，促使向这些组合方法转变。然而，关于最佳选择标准和治疗疗效预测标志物的几个问题仍然存在。尽管一些研究已经识别出与PARP合成致死的基因，但成功转化为临床应用的与PARPIs联合治疗的药物数量仍然有限。

我们使用具有功能性BRCA1/2的前列腺癌细胞系的18,010基因sgRNA文库进行了全基因组CRISPR-Cas9敲除筛选。PARPIs显著减少的基因的GO分析揭示了在DU145和22Rv1细胞中富集的与DNA修复和复制相关的通路。从这些基因中，我们聚焦于LIG1，它参与DNA修复通路，并排名前10，作为与PARPIs显示合成致死的有前景候选基因。根据使用CRISPR筛选前列腺癌细胞的研究，LIG1是PARP的关键合成致死伙伴。在完成本研究时，Fracassi等人使用DNA损伤修复基因的定制sgRNA文库报道了LIG1作为与PARP显示合成致死的基因，报告了LIG1与PARP的关系。我们在体内评估了奥拉帕利和L82-G17的组合，并研究了LIG1在人前列腺组织中的表达。

LIG1对DNA复制和碱基切除修复至关重要；当其缺失时，涉及LIG3-XRCC1复合物的补偿修复机制被激活，部分替代LIG1。在LIG1敲除前列腺癌细胞系中，其活力不受影响。相反，当用奥拉帕利处理LIG1敲除前列腺癌细胞时，细胞活力显著降低。此外，当用奥拉帕利处理LIG1敲除前列腺癌细胞系时，DNA损伤增加，并诱导凋亡。当LIG1缺陷时，聚(ADP-核糖)被激活，这对于招募LIG3-XRCC1复合物到DNA损伤位点至关重要。由于PARP1/2识别由LIG1缺陷产生的未连接Okazaki片段之间积累的单链断裂，促进了这些位点增强的PAR合成。因此，考虑到LIG1和PARP1/2抑制联合时会显示合成致死是合理的。

Li等人报道CRPC细胞显示几种HRR相关基因表达增加。其中，LIG1 mRNA表达在CRPC中高于正常前列腺和局部前列腺癌组织，证明LIG1作为治疗靶点的合理性。LIG1的突变频率在TCGA的CRPC数据集中约为6%，表明其作为PARPIs疗效预测生物标志物的价值。免疫组化证实LIG1在CRPC组织中比正常前列腺和局部前列腺癌组织过表达。LIG1过表达与卵巢癌中的肿瘤侵袭性和不良预后相关。LIG1的多态性变异可能影响肺、上消化道和头颈癌。这些发现表明LIG1抑制剂可能在癌细胞中发挥选择性毒性，同时保留正常细胞。据报道，LIG1抑制剂在正常前列腺细胞中的毒性低于前列腺癌细胞系。

我们测试了LIG1抑制剂和PARPIs的组合。通过对LIG1-切口DNA复合物的计算机结构基础筛选，识别出小分子LIG1抑制剂，包括L82、L67和L189。此外，L82-G17是新一代抑制剂，对LIG1具有优异的选择性和效力。我们发现L82-G17与PARP抑制剂奥拉帕利具有协同作用，显著降低多种前列腺癌细胞系的活力。相反，L82、L67和L189与奥拉帕利没有显示协同作用，可能是因为L82-G17是DNA磷酸化反应第三阶段磷酸二酯键形成的非竞争性抑制剂；积累的DNA腺苷酸中间体可能 contribute to this。PARP被困的DNA结构未知；最近，有人提出游离的Okazaki片段是此类结构。因此，由L82-G17积累的DNA腺苷酸中间体可能增强PARPIs与DNA结合的能力，通过PARP trapping增强其细胞毒性。

在本研究中，使用具有功能性BRCA的前列腺癌细胞系，我们证明了由L82-G17和奥拉帕利组合诱导的新型合成致死机制即使在无BRCA突变的细胞中也有效。这表明这种联合疗法可以扩大治疗选择，适用于先前限于治疗替代方案的患者群体。Ali等人报道HDR缺陷细胞对LIG1抑制剂表现出超敏反应，暗示L82-G17作为单药治疗在HDR缺陷癌症中也可能有效。

据我们所知，这是L82-G17与奥拉帕利的首次体内研究。这种组合增强了治疗效果，并且与对照组或单药治疗组相比未导致小鼠体重减轻，表明其发挥了肿瘤选择性效应，对正常组织毒性最小；这可能 due to 肿瘤组织中LIG1的较高表达。对LIG1和PARP抑制的反应在肿瘤类型之间不同，组织特异性LIG1表达水平可能影响治疗结果。

本研究存在局限性。我们在DU145异种移植模型中证明了L82-G17和奥拉帕利的体外协同作用，但未完全探索长期疗效和潜在耐药性的出现。协同机制，特别是PARP trapping和LIG3-XRCC1通路的补偿激活，需要进一步研究。尽管初步体内毒性数据有希望，但在考虑临床应用之前，需要分析正常组织中的脱靶效应和全身毒性。用于LIG1免疫染色的人组织样本数量少，可能限制我们关于LIG1在临床样本中表达结果的普适性。

总之，LIG1可能提高PARPIs效率。LIG1抑制剂L82-G17和奥拉帕利在具有或不具有BRCA突变的前列腺癌细胞中显示协同效应，可能扩大服务不足患者的治疗选择。