藜麦WOX转录因子家族的全基因组鉴定与盐胁迫响应的生物信息学分析揭示其发育与抗逆调控机制

本综述首次系统鉴定藜麦（Chenopodium quinoa）WOX（WUSCHEL-related homeobox）基因家族，发现13个CqWOX成员并分为三大进化亚组（ ancient/intermediate/WUS subgroup）。研究通过共线性分析揭示基因复制事件，启动子顺式元件分析发现激素响应（ABRE/AuxRR-core）和胁迫响应元件（MBS/MYC），蛋白互作网络显示与CLV-WUS信号通路关键组分（CLV3/CLV1/CLE40）互作。转录组分析表明CqWOX7和CqWOX11在盐腺中特异性上调，提示其在藜麦盐适应中的关键作用，为作物抗逆育种提供新靶点。

　　

1. 引言

WUSCHEL相关同源盒（WOX）基因家族编码植物特有的转录因子，在植物形态建成和发育调控中发挥核心作用。该类蛋白含有60-66个氨基酸组成的保守同源域（homeodomain），作为DNA结合域调控下游基因表达。在高等植物中，WOX家族根据系统进化关系可分为三大亚组：仅存在于种子植物的WUS/modern亚组、维管植物特有的intermediate亚组以及非维管和维管植物共存的ancient亚组。模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中存在15个AtWOX基因，其中WUS亚组成员数量最多且功能研究最为深入。首个发现的WOX基因WUS是维持茎端分生组织和花器官发育的关键调控因子。

WOX家族基因作为多功能转录因子，参与植物全生命周期的生长发育过程，从分生组织维持、胚胎模式建成到侧器官发育及非生物胁迫响应。该家族基因在从绿藻到高等植物的广泛物种中存在，且基因数量随进化逐渐增加。藜麦作为营养丰富的传统粮食作物，具有耐寒、耐盐、耐旱和耐贫瘠土壤的突出特性，但其WOX基因家族尚未被系统研究。本研究首次对藜麦WOX基因家族进行全基因组鉴定，通过生物信息学分析揭示其系统发育关系、保守结构域、基因结构、染色体分布、顺式调控元件和复制事件，为理解藜麦发育和胁迫响应的分子机制提供理论基础。

2. 材料与方法

2.1. CqWOX蛋白的鉴定与特性分析

从Plant TF数据库获取拟南芥、水稻（Oryza sativa）、甜菜（Beta vulgaris）、紫穗苋（Amaranthus hypochondriacus）和菠菜（Spinacia oleracea）的WOX蛋白序列。以AtWOX序列为查询序列，在Phytozome V13数据库中进行BLASTP检索（E值<1e^-10）。通过Expasy在线平台去冗余（序列相似性>90%阈值），使用SMART工具验证同源域（PF00046）的存在。通过ClustalX 2.1进行多序列比对鉴定DNA结合的螺旋-环-螺旋-转角-螺旋结构域。利用ProtParam工具计算理论等电点（pI）和分子量（MW），BUSCA工具预测亚细胞定位。

2.2. CqWOX蛋白的分子建模

使用SOPMA在线工具预测二级结构（α-螺旋、无规卷曲、β-转角、延伸链），SWISS-MODEL服务器构建三维结构模型。

2.3. 染色体定位、系统发育与共线性分析

通过OMA浏览器确定染色体位置，MG2C V2.1进行物理定位。使用ClustalX 2.1进行多序列比对，基于邻接法（neighbor-joining）构建系统发育树（2000次 bootstrap重复）。利用TBtools软件中的MCScanX分析藜麦与四种作物（拟南芥、甜菜、菠菜、紫穗苋）的全基因组共线性关系。

2.4. 保守基序、基因复制与Ka/Ks分析

通过MEME Suite鉴定保守基序（最大15个基序，宽度6-50氨基酸，E值<0.05）。使用TBtools中的"Simple Ka/Ks Calculator"计算非同义（Ka）和同义（Ks）替代率，Ka/Ks<1表示纯化选择，Ka/Ks=1为中性选择，Ka/Ks>1为正选择。基因对分化时间计算公式为T=Ks/2λ（λ=6.5×10^-9）。

2.5. 启动子分析、蛋白互作网络与基因本体富集

提取转录起始位点上游2000 bp序列作为启动子区，PlantCARE数据库预测顺式作用元件。STRING软件构建蛋白互作网络，ShinyGO 0.82进行GO注释分析。

2.6. RNA-Seq数据分析

分析NCBI BioProject PRJEB22942（盐腺、无腺体叶片、全叶转录组）和PRJNA605324（盐胁迫转录组）数据。使用TPM法量化表达水平，Baggerley检验鉴定差异表达基因（FDR<0.05，|fold change|≥1.5）。

3. 结果

3.1. CqWOX蛋白的鉴定与特性

在藜麦基因组中共鉴定13个WOX编码基因，根据染色体位置命名为CqWOX1-CqWOX11和CqWUS1、CqWUS2。蛋白长度159-676氨基酸，分子量18.5-76.72 kDa，等电点5.15-9.47。亚细胞定位预测显示除CqWOX2定位于叶绿体外，其余均定位于细胞核。染色体定位分析显示12个基因分布于9条染色体，1个未定位（染色体0）。染色体3、7、18各含2个WOX基因，其余染色体各1个。

3.2. CqWOX基因的系统发育与共线性分析

对6个物种71个WOX蛋白（拟南芥16、甜菜8、菠菜9、紫穗苋11、水稻14、藜麦13）进行系统发育分析，明确分为三大进化亚组。WUS亚组包含8个CqWOX成员，数量最多。共线性分析显示CqWOX基因与三种苋科植物WOX基因存在12个直系同源，与拟南芥存在10个直系同源。CqWOX7和CqWOX10与甜菜和紫穗苋的WOX基因存在多个直系同源对，表明这些基因在进化中发挥重要作用。仅CqWOX4未在其他物种中发现。

3.3. CqWOX基因结构与保守基序分析

外显子-内含子结构分析显示外显子数量2-7个，30.7%基因含2个外显子，30.7%含4个外显子。基因结构与系统发育关系高度相关。在WUS亚组成员中发现WUS-box（TLXLFP）和EAR-like基序（LXLXL）。所有CqWOX蛋白均含Motif 2，Motif 11和13为intermediate亚组特有，Motif 1广泛存在于多数蛋白。多序列比对显示所有CqWOX蛋白均含保守的DNA结合螺旋-环-螺旋-转角-螺旋结构域。

3.4. CqWOX蛋白的分子建模

三级结构预测显示所有13个CqWOX蛋白均含保守的螺旋-环-螺旋同源域。二级结构预测表明无规卷曲占比最高（60.38%-78.11%），α-螺旋占9.88%-25.26%，β-转角仅占1%-6%。

3.5. 藜麦WOX家族的基因复制事件

鉴定出5对片段重复基因对：CqWOX9/CqWOX8、CqWOX2/CqWOX3、CqWOX5/CqWOX6、CqWOX10/CqWOX7和CqWUS1/CqWUS2。所有基因对的Ka/Ks值均小于1（0.04-0.21），表明经历纯化选择。复制事件发生时间估计为6.52-14.62百万年前。

3.6. CqWOX启动子顺式元件检测

启动子分析鉴定出16类顺式作用元件，分为激素响应、胁迫响应、生长发育和光响应四大类。光响应元件（GT1-motif、G-box、ATCT-motif、GATA-motif、Box 4）和MYB结合位点存在于所有CqWOX基因，MYC结合位点存在于84.6%基因（CqWUS1和CqWUS2缺失）。CqWOX5、CqWOX8和CqWUS2含最多光响应元件，CqWOX9和CqWOX2含最多顺式元件类型。玉米醇溶蛋白代谢调控元件（O₂-site）和类黄酮生物合成调控元件（MBSI）分别特异性存在于CqWUS和CqWOX7。

3.7. CqWOX蛋白互作网络与基因本体富集

蛋白互作网络包含16个节点（6个拟南芥WOX蛋白和10个互作蛋白：ESR2、T26M18.140、ATHB-8、CLE44、CLE8、CLV1、CLV3、CLE40、CLE41、YAB1）。GO分析显示CqWOX基因参与发育过程、系统发育、多细胞生物发育和解剖结构形态建成等生物学过程，以及核酸结合、DNA结合、转录因子活性和转录调控活性等分子功能。

3.8. RNA-Seq数据分析

转录组分析显示5个CqWOX基因在盐腺组织中差异表达。CqWOX1、CqWOX4和CqWOX9在叶片中高表达（fold change>3），在盐腺中抑制；CqWOX7和CqWOX11在盐腺中上调（fold change<-2），提示其在盐腺形成或功能中的潜在作用。盐胁迫下表达谱显示CqWOX9在茎中上调（fold change=1.8），CqWOX4在根中下调（fold change=-1.7），表明器官特异性调控。

4. 讨论

WOX家族成员数量在植物物种间存在差异，但进化保守性强。本研究通过BLAST搜索鉴定藜麦13个含同源域的WOX基因，系统发育分析分为三大亚组。基因数量与基因组大小无直接相关性。亚细胞定位预测显示除CqWOX2外均定位于细胞核，可能与同源域中带正电荷氨基酸残基作为隐蔽核定位信号有关。

片段重复基因对的Ka/Ks值均小于1，表明经历纯化选择，突变可能对胚胎和花发育关键功能有害。保守基序分析发现WUS亚组成员含WUS-box和EAR-like基序，这些基序在干细胞身份调控和 floral meristem大小调控中起关键作用。多序列比对显示同源域中11个氨基酸残基高度保守，二级结构以无规卷曲为主。

启动子分析揭示光响应元件、MYB和MYC结合位点的广泛存在，表明CqWOX基因在光信号转导和胁迫响应中的调控作用。蛋白互作网络显示与CLV-WUS信号通路关键组分互作，包括WUS与CLV3形成的负反馈环路、WOX5与CLE40的调控关系以及WOX4在维管形成层细胞分裂中的功能。GO分析进一步证实CqWOX基因在发育过程和转录调控中的核心作用。

转录组分析揭示组织特异性表达模式，CqWOX7和CqWOX11在盐腺中上调表明其在藜麦盐适应中的潜在功能。拟南芥同源基因功能研究表明AtWOX1参与叶片扩展和边缘形成，AtWOX4与维管模式化和叶复杂性相关，提示CqWOX基因在藜麦叶片发育中的类似功能。

5. 结论与展望

本研究首次在藜麦中鉴定13个WOX转录因子家族成员，分为三大进化亚组。发现5对片段重复基因对且经历纯化选择。启动子分析揭示激素响应、胁迫响应、生长发育和光响应元件的富集。蛋白互作网络显示与CLV-WUS信号通路关键基因的互作关系。转录组分析表明CqWOX基因在盐腺组织和盐胁迫下的特异性调控。这些发现为理解藜麦WOX基因的进化模式和功能多样性提供了重要见解。未来研究可通过CRISPR/Cas9基因编辑等技术进一步验证WOX基因的调控网络及其在增强藜麦抗逆性中的关键作用。