极端长距离迁徙鸟类非繁殖季基础免疫功能动态变化研究：以哈德逊塍鹬为例

本综述聚焦极端长距离迁徙鸟类哈德逊塍鹬（Limosa haemastica）非繁殖季节的基础免疫功能（CIF）动态变化。研究通过比较抵达越冬地初期（post-arrival）与迁徙准备期（pre-migratory）个体的细菌杀伤能力（BKA）、溶血（HL）和血凝（HA）活性，揭示鸟类在羽毛换羽（moult）、能量储备与免疫投资间的生理权衡机制，为迁徙生态免疫学提供新见解。

　　

Abstract

迁徙动物为完成长途旅程常展现出显著的生理适应特征。尽管已有大量证据表明鸟类在繁殖期和中途停歇点存在免疫调节现象，但迁徙鸟类到达非繁殖地后及整个静止季节的免疫状态仍知之甚少。本研究以极端长距离迁徙鸟类——哈德逊塍鹬（Limosa haemastica）为模型，探讨成年个体在两种不同条件下的基础免疫功能（CIF）：一组为刚抵达非繁殖地并正处于初级飞羽换羽期的“抵达后组”，另一组为四个月后、即将北迁并正换羽成繁殖羽的“迁徙前组”。研究发现，两组鸟类的CIF水平相当。分别分析各组时发现，随着鸟类完成繁殖羽换羽，其凝集效价和细菌杀伤能力（BKA）均有所上升，但BKA的上升主要见于雄性个体。此外，迁徙前雌性的BKA高于雄性。而在抵达后组中，初级飞羽换羽进度对CIF参数无显著影响。结果表明，在非繁殖季末期，塍鹬存在重要的免疫调节过程，这可能与为耐力迁徙做准备的深刻生理和代谢变化有关。本研究为极端长距离迁徙鸟类在非繁殖季节的免疫动态这一鲜为人知的主题提供了新的见解。

Introduction

迁徙动物的行为与生理特征常为应对迁徙需求而发生适应性改变，包括发展出复杂的导航能力、空气动力学优化的体型以及高效的能量（脂肪）储存与代谢机制。在迁徙鸟类中，某些物种因其前所未有的迁徙距离和持续时间而表现出极端的适应性。完成迁徙后，鸟类体重可能在短短几天内减少一半，但其为迁徙而预先调整的生理系统会随着强度运动的恢复而逐渐回归基线水平。近期研究表明，基础免疫功能（CIF）——这一在迁徙过程中常被削弱的生理组成部分——在自由生活的迁徙雀形目鸟类于中途停歇点休息几小时后即开始恢复，提示CIF作为一种非特异性且持续存在的第一道防线，在迁徙鸟类中具有可塑性，并受运动等因素调节。事实上，鸟类迁徙与运动相关的免疫调节近年已受到广泛关注，包括对迁徙鸟类中途停歇点“功能”的详细考量。相对而言，针对迁徙鸟类在整个静止非繁殖季节（所谓“越冬季”）免疫状态的研究则明显不足。

对迁徙和非迁徙鸟类年周期的研究揭示了免疫能力存在显著的季节性差异。然而，专门针对迁徙鸟类全年周期免疫调节的研究较少，且这些研究通常仅聚焦非繁殖季节的单一采样事件，难以揭示持续5–6个月的免疫动态变化。这一认知缺口尤为遗憾，因为许多物种在非繁殖季节经历重要的生理过程，包括：1）抵达后不久完成初级飞羽换羽；2）迁离前为获得繁殖羽色而进行的体羽换羽（prealternate moult），这两者均因需要蛋白质合成而被认为是能量消耗巨大的过程；3）在耐力飞行前数周体重显著增加，并投入减少氧化应激等生理调整；4）必须适应新环境，包括可能遇到的新食物来源、气候条件及病原威胁。

尽管维持CIF的能量成本低于激活诱导免疫系统，但个体对CIF的投资差异仍可能受到同一季节其他能量需求过程的影响。迁徙鸟类通常将高需求活动在年周期中分开以避免重叠，这一策略在从事极端耐力飞行的物种中尤为明显。此类耐力飞行的持续时间（通常与迁徙距离相关）也对免疫系统具有影响。研究表明，长距离与短距离迁徙雀形目鸟类在投资策略上存在显著差异。考虑到长距离迁徙鸣禽需要准备持续数天的飞行才能到达非繁殖地，而短距离迁徙者仅需几天，两者间的生理适应存在显著差异并不令人惊讶。然而，对于采取完全不同策略的物种（如许多进行多日耐力飞行的鸻鹬类），关于其在非繁殖地免疫调节的信息则更为稀缺。

本研究利用哈德逊塍鹬探究非繁殖季节的免疫调节。该物种是一种长距离近北极迁徙鸟类，在北极高纬度地区繁殖后，飞行数千公里至巴塔哥尼亚的非繁殖地。研究首先通过比较刚抵达非繁殖地约4–5周的“抵达后组”和四周后准备北迁的“迁徙前组”，探究CIF在非繁殖季节内是否变化。采样时，抵达组个体正在完成初级飞羽换羽，而迁徙前组个体正进行繁殖体羽换羽以获取繁殖羽色。我们利用这些能量需求高的生理过程来探讨其对CIF的影响，包括与性别的潜在关联（因此物种存在明显的反向性二型，雌性体型较雄性大约25%但羽色较暗淡）。

Material and methods

Fieldwork and bird sampling

哈德逊塍鹬于高潮时使用火炮网在智利奇洛埃群岛的两个地点捕获：考林湾和普劳湾。首次捕获于2018年11月17–22日进行，代表刚抵达非繁殖地的鸟类（抵达后组）。该非繁殖地是该物种在太平洋地区最重要的栖息地，约有2万–3万只个体在北极繁殖后抵达，并分散在由数个海湾组成的多个较小地点度过大部分南半球春季和夏季。四个月后，于2019年3月10–12日进行了第二次捕获（迁徙前组）。根据多年一致的抵达和离开日期观察，首次捕获大约在鸟类抵达后4–5周进行，但个体抵达日期可能存在很大差异（最多59天）。第二次捕获在鸟类开始离开前四周进行，有12只GPS标记个体在2019年迁徙的数据支持（中位数4月10日±2.3天）。

Age, sex and body condition parameters

共捕获、采样、测量和环志103只个体。使用肝素化管收集血液样本，储存于4oC并在短时间内（<3小时）以10,000 RPM离心10分钟获得血浆。血浆样本冷冻保存（–80oC）直至分析。从捕获到采血的时间在16至240分钟之间，未发现此时间对任何CIF参数有影响，与既往文献一致。个体身体状况通过缩放质量指数（SMI）评估，该指数通过将体重根据体型（此处为跗跖长度）标准化计算得出。鉴于两性间存在强烈的反向性二型（约25%体型差异），该指数分别针对雌性和雄性塍鹬计算。所有体型测量由同一人完成。年龄等级根据羽饰特征区分，使用Humphrey和Parkes命名法。性别通过基于喙长的形态学方法鉴定，该方法专为此物种开发。非成鸟或无法根据喙长测量确定性别等级的成体被从分析中剔除。虽移除少量性别不确定的个体可能模糊某些模式，但为在研究中可靠地考虑性别变量是必要的。部分个体因特定变量缺失值而在某些分析中被移除。

Moult

成年哈德逊塍鹬的初级飞羽换羽（即预基本换羽）在繁殖季后开始，持续约四个月，但具体开始时间不详。抵达非繁殖地时，成鸟尚未完成飞羽换羽，这在10月初捕获鸟类的羽毛检查中相当明显。成鸟初级飞羽换羽评分遵循Ginn和Melville方法：从最内侧（P1）到最外侧（P10）的每根初级飞羽按0（旧羽）到5（完全长成的新羽）评分，值1–4描述羽毛生长的连续阶段。

为获得繁殖羽而进行的体羽换羽（即预交替换羽）在成鸟离开前两至三个月开始，在非繁殖季末期相当明显。评分系统基于繁殖羽覆盖度（%），从全非繁殖羽为最低分到全繁殖羽为最高分。雄性和雌性得分不同，因其存在性二色性：雌性哈德逊塍鹬的繁殖羽覆盖程度不如雄性，其他塍鹬物种亦然。这意味着分数不能直接在两性间比较，因为雌性和雄性的最大覆盖度由不同值代表。我们通过重新缩放该变量解决此问题，将每性别记录的最小分数（雌性=35，雄性=50）设为0，最大分数（雌性=65，雄性=95）设为1。

Immune parameters

细菌杀伤能力（BKA）通过French和Neuman-Lee描述的方法测定，略有修改。使用5μl血浆与4μl 1.6×10⁵大肠杆菌溶液混合。平板在37°C孵育12小时，随后以200rpm振荡1分钟均质化，并使用酶标仪在600nm读数。相对于不含血浆的孔中大肠杆菌的生长，计算被杀灭的大肠杆菌百分比。每板使用四个阴性对照以确保无污染。我们通过溶血-血凝测定（分别为HL和HA）补充BKA这一综合测量值，以量化免疫系统的两个更具体参数：补体活性和天然抗体。简言之，将健康非怀孕荷斯坦小母牛的红细胞与系列稀释的血浆样本孵育。孵育20分钟后拍摄测定板图像评分凝集，90分钟后拍摄图像评分裂解。所有图像以固定标准化相机设置和支架拍摄。图像随机化，每个系列稀释盲法评分两次。当裂解或凝集的终止不明确时，给予两个效价之间的半分。当两个分数相差小于一个效价时，分析中使用其平均值；当相差大于或等于一个效价时，样本进行第三次评分并使用中位数。样本在两次测定间冻融，但这些测定对反复冻融循环稳健。

Statistical analysis

采用贝叶斯方法，在R统计软件中使用‘MCMCglmm’包进行马尔可夫链蒙特卡罗广义混合模型。选择此方法是因为贝叶斯统计更保守且能更好地处理小样本量。首先探索非繁殖季节内的采样期是否影响CIF，建立以每个免疫参数（BKA、HA和HL）为响应变量，采样期（抵达后与迁徙前）、性别和SMI为解释变量的模型。

在进行其余分析前，通过计算方差膨胀因子（VIF）探讨个体身体状况（即SMI）和两个羽毛换羽变量可能存在的共线性。VIF值低于1.02，表明共线性不是问题。为具体研究初级飞羽换羽和繁殖羽覆盖对CIF的影响，将数据集分为两个子集。通过建立以每个CIF参数为响应变量，换羽分数、性别和SMI为解释变量的模型，研究抵达后鸟类初级飞羽换羽的影响。包括换羽分数与性别的双向交互以探索可能的性别特异性差异。对迁徙前鸟类繁殖羽覆盖的分析采用类似模型，但使用该变量而非换羽分数。繁殖羽覆盖在分析前进行反正弦变换。所有模型使用高斯分布族，除BKA模型使用二项分布。使用基于改进模型收敛的反Wishart先验（固定效应）。迭代次数、 thinning和burn-in分别设置为2,010,000、2000和10,000，以获得1000的有效样本量。通过Gelman–Rubin检验、轨迹图和‘CODA’包中的autocorr()函数评估收敛和自相关水平。MCMCglmm结果表示为后验均值、95%可信区间下限和上限，显著性以pMCMC值表示。

Results

抵达非繁殖地后捕获的鸟类（抵达后组）其SMI显著低于准备返回繁殖地时捕获的鸟类（迁徙前组）。在控制SMI和性别后，两个时期之间的三个CIF参数均无统计学显著差异。然而，对于BKA，存在显著的性别效应：雄性BKA低于雌性。

探究抵达后鸟类初级飞羽换羽对CIF参数影响的分析显示无关联。同样，性别及其与初级飞羽换羽的交互对任何CIF参数均无影响。在准备迁徙的鸟类中，雌性BKA高于雄性，且繁殖羽更先进的个体具有更高的BKA。身体状况无明确影响。在交互模型中，性别与繁殖羽覆盖存在统计学显著的交互作用，BKA仅在雄性中随着繁殖羽覆盖完成而增加。最后，HA与繁殖羽覆盖度呈微弱正相关（在加性模型中估计值勉强排除零），且无与性别交互的支持。HL与任何测试变量均无关联。

Discussion

本研究首次探讨了极端长距离迁徙鸟类在静止非繁殖季节免疫调节这一知之甚少的主题。结果未支持CIF会随相对能量投资而变化的预期。尽管由于迁徙前肥育，两时期间体型校正体重存在显著差异，但三个CIF参数保持不变，尽管雌性BKA略高于雄性。当分别研究每个时期的鸟类时，出现了进一步的性别特异性效应：雌性总体BKA高于雄性，且繁殖羽覆盖度更高的雄性比刚开始换繁殖羽的雄性表现出更高的BKA。有趣的是，随着鸟类扩展其繁殖羽覆盖，它们往往逐渐具有更高的HA，雌雄皆然。这些结果支持了基线CIF在极端长距离迁徙鸟类的非繁殖季节保持相对稳定的观点，并表明繁殖羽覆盖部分影响了鸟类在接近出发进行数千公里无间断耐力飞行时的CIF。

在该研究系统中，塍鹬在抵达奇洛埃前已在少数内陆地区（即奥里诺科或亚马逊盆地内的淡水湿地）中途停歇几天，之后在阿根廷潘帕斯湿地停歇。抵达奇洛埃后，雄性和雌性在4–5个月的非繁殖地期间专门使用潮间带区域。在这些许多方面相对同质的环境中，包括食物来源高可用性和恒定盐度，鸟类可能接触的病原压力远低于内陆栖息地。抵达时，成鸟仍在进行初级飞羽换羽，且尚未在奇洛埃完成较大、最外侧羽毛的生长。飞羽换羽消耗大量资源，因为鸻鹬类的初级飞羽是最大和最重的，由蛋白质（角蛋白）和其他必需微量营养素组成。此外，在其姊妹物种斑尾塍鹬中，最外侧五根初级飞羽（即P6–P10）的质量占所有初级飞羽（即P1–P10）combined质量的70%。因此，完成最外侧初级飞羽的换羽可能是塍鹬抵达奇洛埃后最大的能量投资之一。令人惊讶的是，CIF在我们测量初级飞羽换羽期间保持稳定。一个可能的解释是此期间病原风险较低的情景可能起作用。有某些证据将寄生虫感染与成年雄性红翅黑鹬的BKA增加和金雕雏鸟的HL升高联系起来，但这些证据目前太有限无法定论。此外，虽然塍鹬显得健康，但其病原感染状态尚未研究。

繁殖羽覆盖度是本研究中唯一显示与CIF存在关系的变量。随着鸟类繁殖羽换羽更先进，BKA和HA效价均增加，尽管BKA的关联似乎主要受雄性驱动。在交互模型中，繁殖羽与BKA之间的正相关关系仅在雄性中统计学显著，如交互项所示。在研究的三个免疫参数中，凝集——其次是抗菌能力——可以说是能量成本最高的。BKA和HA效价主要依赖于天然抗体活性，其维持比补体系统更耗能，因为产生和维持抗体水平，尤其是在抗原挑战期间，涉及蛋白质合成、细胞激活和持续监视。这可以部分解释为何凝集效价随着鸟类完成繁殖羽覆盖而逐渐增加，可能反映了产生这种特定黑色素基色素的高成本。此外，由于氢过氧化物抑制角质形成细胞增殖，且塍鹬在迁徙前肥育阶段末期显著降低其浓度，这些鸟类在完成繁殖羽覆盖后能够增加基线免疫功能的能量支出。由此看来，尽管雄性的BKA相对低于雌性，但几乎完成繁殖羽换羽的雄性比处于较早阶段的雄性表现出更高的BKA。由于成鸟在非繁殖季末期也增加基础代谢率并减少氧化应激，我们的结果可能提示CIF投资与其他高成本活动之间存在时间权衡。然而，这种可能的权衡似乎不大，因为它仅涉及雄性的BKA且仅对HA显著。有趣的是，这些变化仅在准备耐力飞行的鸟类中检测到，这与Hasselquist和Nilsson的发现一致。

在非繁殖季末期，雄性哈德逊塍鹬可能面临强烈压力，需要在离开前展示全繁殖羽，因为这可能是提高其繁殖机会的关键。类似的性别特异性竞争劣势在其姊妹物种黑尾塍鹬中已有描述，雄性在迁徙准备期间被迫将能量重新导向其他高成本过程。与内分泌系统的交互也可能起作用，因为几种激素介质在繁殖季预期开始前显现。这在迁徙准备前的性别特异性激素水平尚未在塍鹬中研究，但不能排除其作为脊椎动物（包括鸟类）中已确立的免疫调节剂的作用。例如，Merrill等发现在成年雄性红翅黑鹬中，BKA与睾酮水平呈负相关，该物种存在性二色性和常规性别角色。

我们承认使用单季节方法若试图揭示根深蒂固的模式可能不是最理想的。然而，可用证据表明研究季节代表了既往季节。例如，3月第二周捕获的成鸟总体身体状况完全基于2017年3月至2024年3月的年度捕获数据落在预期范围内。适当的迁徙时间对于最大化繁殖地的交配机会至关重要，并受到内在和环境因素的精细调节。因此，GPS标记的塍鹬于4月10日离开奇洛埃，与该物种当代离开日期相符，是令人放心的。

极端长距离迁徙鸟类是特殊的研究模型，因为它们允许我们探索动物生理学的极限。在我们的工作中，我们观察到CIF的变化可能由与非繁殖季末期发生的其他能量需求过程的权衡驱动，特别是在雄性中，它们可能在与较大雌性准备迁徙回繁殖地时处于竞争劣势。这种基线免疫调节是否直接源于与其他能量消耗过程的权衡仍有待确定。因此，我们的结果可以支持氧化应激在介导免疫激活中可能相关的假设，尽管需要进一步研究来证明这种关联。最后，我们的结果表明，在南半球高纬度非繁殖地进行研究——一些极端长距离迁徙鸟类在此度过一年中大部分时间——可能产生与迁徙策略相关生理功能的有价值见解。

Acknowledgements

我们感谢鸟类生态实验室（BEL）其他成员以及C. Verdugo在捕获期间提供的支持。我们感激J.A. Masero审阅了手稿的早期草稿。

Funding

JOV由ANID, FONDECYT postdoctorado ID: 3220722资助。JGN由ANID Millennium Science Initiative Program – ICN2021_002资助。

Permits

捕获和采样在智利Austral大学生物伦理批准号260/2016和智利政府SAG许可号5932/2016下进行。

Author contributions

José O. Valdebenito: 概念化（平等）；数据管理（平等）；形式分析（平等）；调查（平等）；方法论（平等）；项目管理（平等）；撰写初稿（平等）；审阅编辑（平等）。Valeria Araya: 数据管理（平等）；方法论（平等）；资源（平等）；撰写初稿（平等）；审阅编辑（平等）。Enzo Basso: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Gabriela Biscarra: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Camila Gherardi-Fuentes: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Natalia Martínez-Curci: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Daniela P. Nualart: 调查（平等）；方法论（平等）；资源（平等）；验证（平等）。John Quiroga: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Jorge Ruiz: 方法论（平等）；资源（平等）；监督（平等）；审阅编辑（平等）。Luis Vargas-Chacoff: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Jonathan Vergara-Amado: 方法论（平等）；资源（平等）；审阅编辑（平等）。Juan G. Navedo: 概念化（平等）；资金获取（平等）；调查（平等）；方法论（平等）；资源（平等）；监督（平等）；撰写初稿（平等）；审阅编辑（平等）。