空间转录组学揭示复发性胶质母细胞瘤对PD-1阻断治疗无应答的肿瘤微环境机制

本刊推荐：为解决PD-1抑制剂在复发性胶质母细胞瘤（GBM）临床疗效不佳的机制问题，研究人员通过空间转录组学技术（GeoMx DSP）对接受新辅助纳武利尤单抗治疗的复发GBM样本开展研究。结果显示PD-1阻断未能引起肿瘤细胞（SOX2+）和肿瘤相关巨噬细胞（IBA1+）的显著转录组变化，包括细胞周期、干扰素信号和髓系程序等关键通路均未发生响应。该研究从空间分子层面解释了免疫治疗耐药机制，为GBM精准免疫治疗策略提供了重要理论依据。

　　

在恶性脑肿瘤的治疗领域，胶质母细胞瘤（Glioblastoma, GBM）始终是神经肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。这种侵袭性极强的肿瘤不仅生长迅速，还具有高度的异质性和免疫抑制性微环境特征，导致其对常规放化疗及新兴免疫治疗均表现出顽固的抵抗力。尽管免疫检查点抑制剂，特别是程序性死亡蛋白1（PD-1）阻断剂，在黑色素瘤、肺癌等多种癌症治疗中取得了革命性突破，但在GBM的临床试验中却屡遭挫败。这种临床疗效与机制认知之间的巨大落差，促使科学家们深入探索PD-1阻断在GBM肿瘤微环境（Tumor Microenvironment, TME）中的真实生物学效应。

以往研究大多聚焦于T细胞应答，但GBM中T细胞浸润稀疏（仅占1-2%细胞比例），而肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-Associated Macrophages, TAMs）却是TME中最主要的免疫群体，具有显著的异质性和免疫抑制功能。近年来有研究表明PD-1在结肠癌TAM表面表达并可调控其吞噬功能，但在GBM中PD-1阻断对TAM和肿瘤细胞本身的影响仍不明确。此外，既往转录组研究结果存在不一致性：部分研究报告了PD-1阻断后T细胞激活和干扰素信号上调，另一些研究则未观察到显著变化。这些矛盾可能源于技术限制（如批量转录组测序无法解析空间异质性）或患者选择偏差。

为解决这一难题，由Sara Blaabjerg Artzi和Bjarne Winther Kristensen领导的研究团队在《Acta Neuropathologica》发表了最新成果。他们采用前沿的空间转录组技术——Digital Spatial Profiling（GeoMx DSP），对复发性IDH野生型GBM患者样本进行高分辨率分子表型分析，重点关注PD-1阻断后肿瘤细胞和TAM的转录组变化。研究纳入26例匹配原发与复发肿瘤样本，其中16例接受新辅助纳武利尤单抗（nivolumab）治疗，10例作为未治疗对照组。通过组织微阵列（TMA）构建和多重荧光标记（SOX2⁺标记肿瘤细胞，IBA1⁺标记TAM），研究团队在细胞群体水平实现了空间分辨的转录组分析。

关键技术方法包括：从CA209-9UP临床试验队列（NCT03890952）获取FFPE组织样本；通过GeoMx DSP平台进行全转录组空间分析；利用免疫组化（IHC）定量PD-1蛋白表达；采用inferCNV和特征评分进行肿瘤纯度控制；使用线性混合模型和DESeq2进行差异表达分析。

研究结果通过多维度分析揭示了一系列重要发现：

Study design and patient cohort

研究人员构建了包含30例复发性GBM患者的队列，其中20例来自纳武利尤单抗临床试验，10例为匹配对照组。通过严格临床参数匹配（年龄、性别、绩效状态等）最大限度减少混杂因素。

GeoMx spatial profiling of tumor cells and TAMs

利用GeoMx人类全转录组图谱（WTA）对FFPE-TMA样本进行空间分析，平均每个AOI包含约1,100个SOX2⁺细胞和245个IBA1⁺细胞，成功实现了肿瘤细胞与TAM的空间分辨转录组捕获。

Genomic profiling reveals hallmark GBM features and inter-patient heterogeneity

基因组分析显示GBM标志性变异（7号染色体增益和10号染色体缺失）以及EGFR扩增、CDKN2A/B缺失等常见基因组改变，证实队列的分子特征符合典型IDH野生型GBM。

Addressing low tumor purity in recurrent GBM samples

研究人员开发了两步过滤策略：首先通过推断拷贝数变异（CNV）识别具有GBM典型染色体改变的AOI；其次通过恶性特征评分排除非恶性细胞污染区域，确保了肿瘤细胞转录组分析的可信度。

Quantification of PD-1 expression by immunohistochemistry

PD-1蛋白表达分析显示，复发肿瘤中PD-1⁺细胞比例较原发肿瘤有所增加（治疗组从1.11%增至3.11%，p=0.0156），但治疗组与对照组间无显著差异，表明PD-1表达增加可能是疾病进展而非治疗特异性反应。

Spatially resolved transcriptional analysis reveals no significant impact of PD-1 blockade

核心发现表明：PD-1阻断未引起SOX2⁺肿瘤细胞或IBA1⁺ TAM的全局转录组改变；主成分分析显示治疗组与对照组完全重叠；恶性细胞状态（Neftel分型）、细胞周期活性（G1/S和G2/M期）、干扰素信号响应和髓系程序（包括补体、清道夫、小胶质和系统性特征）均无显著变化。

研究结论部分明确指出，新辅助PD-1单药治疗在复发性GBM中未能诱导肿瘤细胞或TAM的可测量转录组响应。这种缺乏分子水平应答的现象与临床试验中缺乏生存获益高度一致，凸显了GBM对免疫检查点抑制剂的先天性和适应性抵抗机制。

讨论部分深入剖析了可能的原因：GBM的免疫抑制微环境特征（包括低肿瘤突变负荷、物理屏障和显性髓系抑制）；T细胞稀疏性限制了免疫应答的幅度；治疗持续时间（单次新辅助剂量）可能不足；技术灵敏度限制（空间转录组而非单细胞分辨率）。与既往研究的差异可能源于本研究更严格的样本选择（仅IDH野生型）、空间分辨分析技术和严谨的对照组设计。

该研究的重要意义在于提供了空间分子层面的证据，解释为何PD-1单药治疗在GBM中屡屡失败。研究表明，即使证实药物到达肿瘤部位并结合T细胞（如既往流式细胞术所示），这种应答也不足以引发肿瘤细胞或TAM的转录重编程。这提示未来免疫治疗策略需要超越T细胞中心视角，直接靶向髓系细胞群，或采用联合免疫治疗方案。同时，研究展示了空间转录组技术在评估复杂肿瘤微环境治疗响应中的价值，为未来临床试验设计提供了重要方法论参考。

总之，这项研究从空间分子层面揭示了GBM对PD-1阻断的耐药机制，强调了克服髓系免疫抑制和开发联合治疗策略的必要性，为改善GBM免疫治疗疗效提供了关键理论基础。