甘蓝型油菜白斑病抗性基因的首次全基因组关联分析揭示关键抗性位点与候选基因

本刊推荐：本研究首次通过全基因组关联分析（GWAS）在甘蓝型油菜中鉴定出与白斑病（由Neopseudocercosporella capsellae引起）抗性相关的基因组区域，发现位于A07、A09和C04染色体上的五个显著位点，其中A09上的主效位点可解释58.94%的子叶抗性表型变异。研究通过连锁不平衡（LD）分析精细定位候选区域，并利用RGAugury管道预测出20个可能的抗性（R）基因（包括NLRs、RLKs、RLPs和TM-CCs），为油菜抗病育种提供了重要的分子标记和基因资源。

　　

1 引言

白斑病是由真菌病原体Neopseudocercosporella capsellae引起的十字花科植物叶部病害，近年来其发生率和严重程度不断增加，尤其在澳大利亚造成了严重的产量损失。该病害主要影响叶片，但也能侵染茎和角果，已导致法国15%和澳大利亚24%的产量损失，在澳大利亚西部甚至超过30%。气候变化通过改变农业气候条件影响植物病原体的出现和分布，促进了病害的暴发。分布模型显示，由于作物可用性的增加以及温度和降雨的有利变化，作物害虫和病原体总体呈现纬度转移的趋势。

尽管白斑病的经济重要性被低估，但其有效管理策略却很少受到关注。轮作和残茬管理是推荐的减少接种体水平的措施，但只是间接且部分有效。杀菌剂处理通常不经济，除非与其他病害同时发生。因此，遗传抗性是最经济有效和可持续的控制策略。宿主抗性的探索几乎完全集中在澳大利亚，因为该病害在那里比其他种植区构成更严重的威胁。在多样的十字花科种质资源中，病害症状从高度感病到完全抗病均有表现，表明遗传抗性是存在的。澳大利亚甘蓝型油菜品种通常具有中等水平的抗性，但品种Oscar和ATR-Stubby表现出高度抗性。

白斑病抗性的遗传基础在甘蓝型油菜中了解甚少，迄今为止尚无任何芸薹属物种中白斑病抗性的遗传研究报道。因此，没有与白斑病抗性相关的遗传标记、抗性数量性状位点（QTL）或抗性（R）基因被鉴定。这一障碍阻碍了抗性在育种计划中的应用，如果病害变得更加普遍，可能会危及有效的长期管理。本研究旨在在一个多样的甘蓝型油菜面板中鉴定与抗性相关的基因组区域，是首次在芸薹属物种中定位白斑病抗性的研究，为靶向育种白斑病抗性改良优良种质提供了基础信息。

2 材料与方法

2.1 植物材料

评估了215个甘蓝型油菜基因型的白斑病抗性。该面板主要包括来自澳大利亚的育种系和商业品种（101个），但也包括来自印度的具有B基因组渗入的育种系（44个）、来自印度的合成系（23个）、来自欧洲的育种系和品种（34个）以及来自中国的育种系（12个）。

2.2 病害筛选和表型分析

分别针对子叶和叶片感染进行了两个重复实验。这些实验在具有自然光照的植物培养室玻璃温室中进行，保持在18°C/14°C（昼/夜），每个实验每个基因型有四个重复植株。使用了先前收集的来自西澳大利亚的N. capsellae分离株UWA Q15.2、来自南澳大利亚的UWA 83.64以及来自维多利亚的UWA DK18.34和UWA DK3。这些分离株从2016年澳大利亚三个州（南澳大利亚、西澳大利亚和维多利亚）调查中收集的感染甘蓝型油菜叶片中获得。

对于子叶抗性研究，接种物通过从菌丝菌落活跃生长部分提取约3 mm²的小琼脂方块制备。将两个2 mm陶瓷珠和1.2 mL蒸馏水加入2 mL Eppendorf管中，同时加入琼脂方块。使用Precellys Evolution组织匀浆器以6800 rpm进行三个20秒循环匀浆菌丝。由于人工产生孢子的困难，使用了菌丝片段而不是孢子。使用血球计数板计数菌丝片段数量，并用蒸馏水调整最终悬浮液浓度至4 × 10⁶菌丝片段/mL。然后在10天生子叶的四个裂片上各施加10 μL菌丝片段悬浮混合物（即每个基因型的每个重复植株的四个子叶裂片各一滴）。接种后4天通过应用先用去离子水雾喷湿的塑料覆盖物维持高湿度。接种后8天（dpi）按照Eshraghi等人描述的0-9评分标准测量病害症状，然后计算每个基因型×处理×重复的四个子叶裂片的平均病斑直径，并将0-9分数转换为子叶病害指数（%CDI）。

对于叶片抗性研究，当测试基因型平均具有四对真叶时进行植株接种。接种通过制备和应用菌丝接种物进行，如下所述：将上述用于子叶接种研究的相同四个分离株首先在MEA上亚培养，在20°C下培养至少2周，然后用手术刀从每个分离株的前缘刮取菌丝并无菌转移至含有150 mL麦芽提取物肉汤（MEB）的250 mL锥形瓶中。液体培养在旋转平台摇床（Innova 2100, New Brunswick Scientific）上以150 rpm、25°C培养。14天后，将所有四个分离株的具有丰富菌丝生长的肉汤培养物等体积混合，并混合5分钟（Kambrook, Mega Blender）以制备N. capsellae菌丝片段接种物混合物。最终菌丝片段浓度调整至4 × 10⁶/mL。使用手持气溶胶喷雾器（Aqua system）用该菌丝片段悬浮液喷雾接种植株。接种后4天通过应用先用去离子水雾喷湿的塑料覆盖物维持高湿度。首先，叶片病害发生率（LDI）在0-10尺度上视觉评估，其中0 = 无病害，1 = 1%–10%，2 = 11%–20%，3 = 21%–30%，4 = 31%–40%，5 = 41%–50%，6 = 51%–60%，7 = 61%–70%，8 = 71%–80%，9 = 81%–90%，10 = 91%–100%叶片感病。其次，叶片病害严重度（LDS）评估为全株感病叶面积比例，计算每个植株所有叶片的感病面积，并使用相同的0-10尺度量化占总叶面积的百分比。然后将0-10叶片病害发生率和严重度分数分别转换为百分比叶片病害发生率（%LDI）和百分比叶片病害严重度（%LDS）。

关于实验设计和统计分析，原始和重复子叶及叶片感染实验均安排为完全随机设计，使用GenStat第22版的“生成标准设计”功能生成。子叶和叶片研究的两个实验数据集之间使用t检验或比较重复实验间材料反应的F检验均无显著差异（p > 0.05）。因此，将两个数据集合并并作为一个单一数据集重新分析，使用GenStat中的方差分析（ANOVA）。使用p < 0.05的Fisher最小显著差异（LSD）识别处理间的显著差异。使用R中的Shapiro-Wilk正态性检验分析合并数据集的正态性。使用相同合并数据集，使用Kendall相关方法测试%CDI、%LDS和%LDI之间的相关性。选择Kendall相关是因为它在没有正态性或线性假设的情况下检查单调关系。使用R中的cor.test函数计算Kendall's tau（τ）和相关性p值，针对双侧假设进行检验。使用R中的ggplot2生成相关散点图。

2.3 DNA提取和单核苷酸多态性基因分型

使用DNeasy Plant Mini Kit（Qiagen）从200 mg幼嫩叶片组织中提取DNA，按照制造商说明进行。为评估浓度，使用dsDNA Broad Range Assay kit（Invitrogen）在Qubit 3.0荧光计上量化总DNA。使用NanoDrop分光光度计（Thermo Scientific）和LabChip GX Touch 24核酸分析仪（PerkinElmer）检查DNA质量。所有样品稀释至50 ng/μL进行基因分型。

使用芸薹属60K Illumina Infinium SNP阵列（Illumina）对每个样品进行基因分型，按照制造商说明进行。简而言之，200 ng基因组DNA与阵列杂交，然后使用iScan微阵列扫描仪（Illumina）扫描。使用Clarke等人开发的A/C聚类文件在GenomeStudio v. 2011.1（Illumina）中将扫描数据转换为单核苷酸多态性（SNP）调用，该文件包含52,157个SNP标记，分布在甘蓝型油菜的A和C亚基因组中。基于它们在Darmor-bzh v10中的位置添加每个SNP的物理位置和染色体。在所有个体中调用率< 80%的SNP从进一步分析中移除。

2.4 全基因组关联研究和连锁不平衡分析

使用GAPIT 3.0包在R中进行全基因组关联研究（GWAS）分析。最终SNP基因型数据以hapmap文件形式输入，每个表型的过滤分数被添加。主成分和亲缘关系分析在GAPIT中自动计算，使用Zhang亲缘关系算法计算亲缘关系。使用Fikere等人描述的公式和p值阈值p = 1.27 × 10^?6计算错误发现率（FDR）。运行了多个GWAS统计模型，包括广义线性模型（GLM）、混合线性模型（MLM）、多基因座混合线性模型（MLMM）、逐步排除关系下的MLM定居（SUPER）、固定和随机模型循环概率统一（FarmCPU）以及贝叶斯信息和连锁不平衡迭代嵌套关键途径（BLINK）。使用R中的CMPlot包生成SNP密度图、GWAS曼哈顿图和分位数-分位数（QQ）图。

进行连锁不平衡（LD）分析以确定GWAS检测到的显著SNP周围是否存在LD区块。使用R中的IntAssoPlot包生成LD矩阵。使用“IntRegionalPlot”功能绘制显著SNP及其在不同碱基对（bp）距离下的相应LD。使用r²统计量测量LD。每个SNP周围的LD范围用于确定基因组区域的大致大小。

2.5 候选基因鉴定

使用RGAugury管道预测在Darmor-bzh v10中鉴定的基因组区域中推定的R基因，包括核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列（NLRs）、受体样蛋白（RLPs）、受体样激酶（RLKs）和跨膜卷曲螺旋（TM-CCs）。在另外四个甘蓝型油菜参考基因组中鉴定等效基因组区域，以捕获Darmor-bzh v10中可能未注释的额外基因注释。这些基因组代表不同的甘蓝型油菜生态型和起源，包括Express617（欧洲冬性）、No2127（欧洲春性）、Westar（加拿大春性）和ZS11（中国半冬性）。通过Geneious Prime中实施的BLAST搜索（Megablast）评估每个候选基因在四个附加基因组中的序列变异。

3 结果

3.1 病害筛选

对于子叶和叶片表型，病害评级通常连续分布，并显示非正态分布（%CDI: W = 0.91, p = 3.3 × 10^?10, %LDI: W = 0.94, p = 1.3 × 10^?7 和 %LDS: W = 0.95, p = 3.2 × 10^?7）。子叶阶段的评级范围从0到53 %CDI，总体平均为13 %CDI，中位数为11 %CDI。总共有81个基因型显示最小症状（≤ 5 %CDI），其中27个基因型完全抗病（0 %CDI）。%LDI范围从41%到100%，平均和中位数为78%，而%LDS范围从20%到100%，平均为57%，中位数为59%。在显示低%CDI的81个基因型中，59个记录为高%LDI（≥ 80%），25个记录为高%LDS（≥ 80%）。总体而言，来自澳大利亚、欧洲和印度的基因型具有相似水平的子叶抗性，而来自中国的基因型 consistently 更抗病。澳大利亚基因型平均具有比中国、欧洲和印度基因型更高的%LDI和%LDS，中国基因型显示最低的平均%LDI和%LDS。

所有三个表型之间的相关性检验均返回显著p值。然而，%CDI与%LDI以及%CDI与%LDS之间存在弱负相关（τ = ?0.17 和 τ = ?0.25）。这种负相关可能是因为有几个基因型显示低水平叶片抗性但在子叶阶段也显示完全抗性。相反，%LDI和%LDS强正相关（τ = 0.66）。

3.2 SNP分布和群体结构

过滤后保留了39,348个高质量、多态性SNP标记。SNP通常均匀分布在所有染色体上，除了染色体A05、A06和A09的着丝粒区域。总SNP中，47.3%（18,600）分布在A亚基因组，而其余52.7%（20,748）分布在C亚基因组。每染色体平均SNP数为2070。

所有215个基因型对的相对亲缘关系系数范围从0到2，平均为0.43。总共79%的配对亲缘关系系数< 0.5，表明缺乏整体群体结构，大多数基因型远缘相关。然而，观察到三个小簇的更密切相关的基因型，代表一组来自欧洲的基因型、具有相似背景的渗入系和来自印度的合成甘蓝型油菜系。

3.3 白斑病抗性的GWAS

为鉴定与白斑病抗性相关的SNP，使用六种不同模型进行了一系列GWAS。经过Bonferroni校正后，显著性阈值计算为p = 1.27 × 10^?6。所有GWAS运行的FDR范围从2.49%到4.99%。GWAS分析鉴定了五个与子叶抗性显著的标记-性状关联（MTAs）。Bn-A09-p35609789被所有六种模型检测到，平均解释58.94%的表型变异，表明是一个主效基因座。此外，Bn-A07-p13485321、Bn-C4-p16786323、Bn-C4-p19675296和Bn-C4-p52507724被四个或更少模型检测到，平均仅解释6.63%、6.53%、7.90%和5.72%的表型变异，表明是微效基因座。仅鉴定到一个叶片抗性（%LDS）的显著MTA。Bn-A09-p30892887被三种模型检测到，解释20.31%的表型变异，表明是一个中效基因座。未发现%LDI的显著MTAs。

3.4 LD分析

整合曼哈顿图与LD热图揭示了与白斑病抗性相关的六个显著SNP周围不同水平的LD。Bn-A07-p13485321、Bn-A09-p30892887、Bn-A09-p35609789和Bn-C4-p52507724显示低水平LD（r² = 0.0–0.2）且不是任何LD区块的一部分。因此，这些SNP的基因组区域定义为标记上游和下游100 kb。另一方面，Bn-C4-p16786323和Bn-C4-p19675296显示强LD（r² = 0.8–1.0）。Bn-C4-p16786323位于一个向上游延伸150 kb的LD区块的下游边缘。该SNP的基因组区域扩展以捕获150 kb LD区块，其中包含Darmor-bzh v10中的21个基因注释。Bn-C4-p19675296是一个极大LD区块的一部分，该区块在染色体C04上向上游延伸3.55 Mb，向下游延伸6 Mb。该SNP的基因组区域捕获了整个9.55 Mb LD区块，并包含Darmor-bzh v10中的439个基因注释。

3.5 候选抗性基因

RGAugury鉴定了20个推定的R基因，位于显著SNP附近或LD区块边界内。A07_1包含两个候选R基因，均属于TM-CC家族。A09_1包含一个候选R基因，也是TM-CC。C04_1包含一个候选R基因，属于RLK家族。在C04_2中鉴定出12个候选R基因，包括来自RLK、NLR和TM-CC家族的基因。在Westar和ZS11的相应区域中检测到一个额外的候选R基因，该基因在Darmor-bzh v10中未注释。C04_3包含一个RLK，A09_2包含两个RLK。

大多数候选R基因在四个参考基因组中与Darmor-bzh v10显示高配对同一性。然而，没有基因在所有四个基因组中 identical，许多基因显示非同义变异。配对同一性从100%到18.3%不等。两个候选基因C04p24980.1_BnaDAR和C04p25820.1_BnaDAR存在于Darmor-bzh v10和Express617中，但在其余三个参考基因组的染色体C04上缺失。

4 讨论

迄今为止，尚无分子研究检查甘蓝型油菜中白斑病的遗传抗性，也未在任何芸薹属物种中报道与抗性相关的基因组区域、QTL或候选基因。这主要是由于该病害最近才作为重新出现的威胁而获得关注，尤其是对油菜而言。然而，预先识别和理解对白斑病的遗传抗性意味着育种者更好地将白斑病抗性纳入商业品种。

子叶和叶片阶段的病害评级通常连续分布，不同基因型表现出不同水平的抗性。这表明抗性是数量性质的，并支持先前的研究，这些研究也在多样种质中测量了广泛的病害症状。当筛选子叶抗性时，27个基因型被分类为具有完全抗性。这些基因型代表了一种资源，可用于育种计划中以选择子叶抗性。事实上，白斑病常见于澳大利亚的油菜幼苗，使得鉴定的抗性特别有希望。

在27个具有完全子叶抗性的基因型中，只有6个是澳大利亚的。这支持了Gunasinghe等人的发现，即澳大利亚基因型通常具有中等抗性，与中国材料中观察到的更强抗性相比。事实上，本研究中测试的中国基因型在子叶阶段表现出一致抗性，表型变异较小，并且在八真叶阶段通常具有较少病害症状。相反，测试的澳大利亚基因型具有比其他所有起源更高的平均%LDI和%LDS。这些结果表明，虽然澳大利亚基因型中存在一些子叶抗性，但早期叶片阶段的抗性通常不存在。这强调了探索更多样甘蓝型油菜种质作为叶片抗性潜在来源的必要性。本研究中和中国基因型中检测到的抗性以及Gunasinghe等人的研究突出了中国种质作为有希望的叶片抗性来源。此外，其他芸薹属物种的基因型在田间表现出强抗性，例如ATC 95966 Bo（欧洲油菜亚种oleifera）和V04A0007（甘蓝变种capitata），可能 potentially 渗入甘蓝型油菜。

使用四个分离株的混合物进行接种，意味着检测到的子叶抗性可能不是分离株特异性的，再次支持抗性是定量控制的观点。使用单个分离株进行进一步筛选可以确定是否存在由主要R基因赋予的抗性。相关性测试显示子叶抗性与叶片病害发生率和严重度均呈弱负相关，表明子叶抗性独立于后期生长阶段的抗性，并且可能以不同方式遗传。这得到了以下事实的支持：许多在子叶阶段表现出完全抗性的基因型在后期八真叶阶段筛选时出现严重病害症状。相反，叶片病害发生率和严重度强相关，表明它们受相似抗性机制控制。

GWAS分析鉴定了染色体A07、A09和C04上的六个显著SNP，与子叶或叶片抗性相关。每个GWAS迭代计算的错误发现率（FDR）未超过5%，表明检测假阳性的概率低。支持这一点的是，除GLM GWAS外，所有Q-Q图显示相似的预期和观察到的p值。这反映了在零假设下与预期结果的最小偏差，并且群体结构和亲缘关系得到充分控制。然而，GLM模型并非如此，该模型已知会膨胀p值，因此可能比更强大的模型遭受更高的FDR。无论如何，Bn-A09-p35609789、Bn-A09-p30892887和Bn-C4-p19675296被多个GWAS模型检测到，提供了这些是真实MTAs的信心。GAPIT的作者指出，基于当前文献，BLINK是其包中包含的统计上最强大的模型。这可能解释了为什么BLINK能够检测到额外的MTAs，尽管它们是微效基因座。

A09_1和A09_2是本研究中鉴定的最有希望的基因组区域，分别解释了子叶病害评级的58.94%变异和叶片严重度评级的20.31%变异。A09_1代表子叶抗性的主效基因座，在成年植株阶段不提供抗性。相反，A09_2代表一个中效基因座，仅在成年植株阶段提供抗性。考虑到本研究中澳大利亚基因型整体缺乏叶片抗性，由A09_2解释的叶片抗性变异可能有价值。然而，应进行专注于叶片抗性的额外作图研究，以鉴定解释更多表型方差的一致抗性QTL。由于Bn-A09-p35609789和Bn-A09-p30892887都不是大LD区块的一部分，基因组区域定义为±100 kb，意味着A09_1和A09_2的大小相对较小，使它们成为靶向选择的理想选择。这与Bn-C4-p19675296形成鲜明对比，其LD区块向上游和下游延伸 several Mb。为确保基因组区域捕获所有连锁基因座，因此C04_2大小为9.55 Mb。然而，该区域仅解释了子叶病害评级的7.14%变异，因此对于靶向选择不太实用，因为由于其大小，它可能包含不需要的等位基因。进一步的精细作图将有助于缩小因果基因座并改善其在育种中的实际应用。其余三个区域A07_1、C04_1和C04_3各仅解释约6%的子叶病害评级变异，代表靶向选择的额外目标。这些微效基因座的价值可能最好通过基因组选择模型实现，这些模型可以更容易地捕获它们的累积效应。

芸薹属物种中白斑病抗性机制的有限知识使得鉴定特定R基因具有挑战性。Gunasinghe等人提出了埃塞俄比亚芥中针对白斑病的两种抗性机制。第一种是病原体识别后快速气孔关闭，随后减少了真菌穿透其宿主的入口点数量。第二种机制与表皮蜡质晶体相关，假设导致分生孢子快速分解和阻碍分生孢子萌发。这些机制是预侵入宿主抗性的例子，因此它们没有揭示植物组织内部发生的分子事件，例如病原体如何被识别。此外，这些是否与甘蓝型油菜中控制抗性的机制相同尚待确认。本研究中鉴定的候选R基因属于在其他芸薹属-病原体相互作用中已知促进真菌病原体识别的基因家族，并作为进一步基因验证的起点。

我们的结果表明抗性是定量控制的，因此突出了模式识别受体如RLKs和RLPs的潜在参与。值得注意的是，两个RLK位于A09_2内，一个RLK位于C04_1内，七个RLK位于C04_2内，一个RLK位于C04_3内。这些RLK在四个参考基因组中也显示序列变异，包括非同义突变，没有基因在所有参考中 identical。不同生态型之间的这种变异表明这些基因中没有一个是完全在甘蓝型油菜基因组中保守的，使它们成为未来研究的有趣候选者。需要进一步调查以确认这些基因参与白斑病抗性。

NLRs参与效应子触发免疫，通常在所有植物生长阶段以超敏反应的形式表现为完全抗性。叶片阶段缺乏完全抗性以及Bn-C4-p19675296仅解释非常小子叶抗性表型的事实表明，在C04_2内鉴定的NLRs不太可能负责抗性。TM-CCs是一类非典型R基因，更频繁地涉及病原体识别和抗性。五个TM-CCs在与子叶抗性相关的基因组区域中鉴定。事实上，位于A09_1内的唯一候选R基因是TM-CC基因A09p65960.1_BnaDAR，它解释了任何鉴定区域中最多的表型变异，并在参考基因组之间显示显著序列变异。TM-CC的一个显著例子是RPW8，在拟南芥中鉴定，赋予对四种引起白粉病病原体的广谱抗性。因此，A09p65960.1_BnaDAR是否有助于子叶阶段对白斑病的广谱抗性将是一个有趣的探索途径。

这是首次研究甘蓝型油菜中白斑病遗传抗性并定位与病害抗性相关基因组区域的研究。我们的发现提供了对抗性遗传基础的初步见解，可以进一步研究以扩展我们对芸薹属物种白斑病抗性机制的知识。白斑病目前是一种重新出现的病害，因为其发生率和严重程度近年来增加，尤其是在澳大利亚。因此，开发抗性品种将是最有效的管理策略，以避免流行病和产量损失。在本研究中鉴定的基因组区域中，A09_1和A09_2特别有希望，因为它们解释了子叶和叶片抗性的有意义比例的变异。这些区域可以通过标记辅助选择靶向，以加强优良油菜种质中的白斑病抗性。