探究母体应激对乳汁糖皮质激素影响：一项多方法研究揭示其因果效应与调节机制

本研究发现，母体急性应激暴露会显著提升乳汁中糖皮质激素（MGCs）浓度及皮质醇/皮质酮比值（CC-ratio），而自我报告的短期情绪状态与MGCs关联不明确。研究采用自然观察与实验设计（TSST应激任务），证实唾液皮质醇反应性与MGCs呈强相关，且心理健康症状调节情绪反应性与乳汁皮质酮的关系。该研究为乳汁成分的应激调控机制提供了因果证据，对理解母婴激素传递及子代发育具有重要启示。

　　

引言

母乳喂养及其营养成分对婴儿长期健康具有不可否认的益处。母乳不仅含有脂肪、蛋白质和微量营养素等营养成分，还包括免疫因子、微生物和激素等非营养生物活性成分。越来越多的证据表明，这些非营养生物活性因子对儿童行为和认知的长期发展有贡献，这一过程被称为乳源性编程（Lactocrine Programming）。乳汁中的主要糖皮质激素（MGCs），即皮质醇和皮质酮，被认为是这一过程的潜在相关贡献者，且在母亲之间存在很大浓度差异。因此，MGCs可能作为一种机制，将重要信息从母亲传递给婴儿，因为新生儿适应接收和利用母体乳汁激素信号进行发育。值得注意的是，配方奶粉中不含有任何MGCs。

鉴于乳汁糖皮质激素可能来源于母体系统循环，母体因素可能影响乳汁皮质醇及其无活性代谢物皮质酮的浓度。其中一个可能影响MGCs浓度的因素可能是母体应激，尽管先前关于母体应激与MGCs之间关联的研究结果不一。这些不一致的发现可能是由于研究设计的巨大异质性，特别是母体应激评估与乳汁样本收集之间的时间间隔变化很大（从几小时到几周不等）。此外，全天乳汁采样的频率和时间也有很大差异。先前的研究主要关注乳汁皮质醇，而在人类乳汁中皮质酮的含量更高。关于母体应激与皮质酮水平或皮质醇与皮质酮比值（CC-ratio，反映11β-羟类固醇脱氢酶2（11β-HSD2）的活性）的关系及其对后代发育的意义，目前了解甚少。

为了更深入了解母体应激对MGCs（即皮质醇、皮质酮）和CC-ratio的影响，我们在产后6至8周左右在同一队列中进行了两项研究。主要假设和分析已在开放科学框架（Open Science Framework）上预先注册。首先，进行了一项自然主义的家庭研究，母亲在一天内三次报告其当前全局情感状态，并同时收集乳汁样本。其次，进行了一项实验研究（随机对照试验；RCT），以测试实验室急性心理社会应激源对应激后MGCs的因果效应。

方法

参与者

参与者来自SMILEY队列（生命早期微生物群和生活方式研究）：一个健康的荷兰母婴二人组社区样本（N=160），从妊娠中期随访至2岁。入组时，孕妇的纳入标准为：年龄≥18岁，掌握荷兰语，单胎妊娠，孕前BMI≤30 kg/m²。研究期间，如果出现严重产科并发症、严重母亲心理或身体健康问题、早产（即<37周 gestation或<2500 g；WHO）和严重发育异常，则排除母婴二人组。自然主义研究的额外纳入标准是母亲每天至少直接母乳喂养四次（24小时）。实验研究的纳入标准是母亲以任何方式给婴儿哺乳。在产后6周，110名母亲的子组收集了自然主义研究的数据，在产后8周，80名母亲的子组参与了实验实验室研究。

自然主义研究

在产后6周（M=6.51，SD=0.47），要求母亲在一天内三次报告其当前全局情感状态，并同时收集乳汁样本。这在给定的时间段内进行三次：上午7:00–10:00（即早晨），中午11:00–下午2:00（即下午）和晚上7:00–11:00（即晚上）。此外，全局情感评估与乳汁样本收集之间的最大接受时间为45分钟。

全局情感通过Monk（1989）的全局情感量表评估，这是一个纸质的视觉模拟量表（VAS），包含四个单项，测量悲伤、紧张、快乐和平静。该量表确保一致性（例如，平静和紧张应呈负相关）且完成快速（ under a minute），减少了参与者负担并最小化了疲劳引起的偏差。视觉模拟格式还通过避免强制选择回答和减少先前答案的影响来增强数据准确性。对于四种感觉中的每一种，参与者被要求在大约10厘米的线上放置一个十字，以指示当时的感觉，范围从最左侧的“完全没有”到最右侧的“非常”。分数通过测量从线开始到十字的距离（毫米）计算，并重新编码为标准范围0–100。全局情感得分通过以下公式计算：[(悲伤) + (紧张) + 200 – (快乐) – (平静)]/4。较高的分数代表更多的自我报告全局情感（范围0–100）。

为了评估乳汁糖皮质激素，要求母亲收集约4 mL的乳汁样本。母亲被指示在给定时间段内母乳喂养婴儿之前收集样本，以确保所有样本都是前乳。由于其他研究目的，早晨样本必须通过手挤收集。对于下午和晚上的样本，允许母亲自行选择乳汁收集方法（例如，使用消毒泵或手挤）。乳汁样本在家中的冰箱中保存，并在实验室访问时用冷却器带来，在-20°C的冰箱中储存。随后，所有样本由研究人员用温控箱带到乌得勒支大学医学中心，使用LC–MS/MS测定皮质醇和皮质酮浓度。CC-ratio（即皮质醇与皮质酮比值）通过皮质醇除以皮质酮计算，较高的比值意味着更多的皮质醇 compared to cortisone。

包括以下混杂因素：婴儿年龄（周）和采样时间。

实验研究

在产后6周（M=6.22，SD=0.39），母亲完成了关于一般和产后特定心理健康症状的在线调查。随后，在产后8周（M=8.20，SD=1.26），母亲和她们的婴儿被邀请到实验室；见图2时间线。介绍后，母亲与婴儿短暂分离进行实验操作。母亲随机接受要么一个改编版的实验室应激测试以诱导急性心理社会应激，要么一个控制任务。同时，保姆（即研究助理）或陪同母亲的人（即伴侣、朋友、家人）照顾婴儿。操作后，母亲与婴儿团聚。在实验操作结束15分钟后，母亲收集一个乳汁样本。在整个访问过程中，参与者完成了四个视觉模拟量表以评估全局情感，并收集了四个唾液样本以测量唾液皮质醇浓度。访问开始时，研究人员解释说，实验室访问的协议是灵活的，可以中断以满足婴儿的需求，例如换尿布或喂养。母亲被告知中断的首选时间，即实验操作之前或乳汁样本收集之后。实验室访问持续2小时。由于皮质醇昼夜节律及其相关的高皮质醇浓度在早晨，实验室访问安排在下午（ between 12:00 h和17:30 h）。

在怀孕期间，参与者被随机分为两组：应激组和对照组。采用分层随机区组随机化方法，1:1分配，以确保初产与经产母亲在应激和控制条件之间的平衡。区组大小从4和6的集合中随机选择。一名不参与SMILEY研究的独立研究人员准备并隐藏了分配序列在钉好的信封中。在怀孕期间的实验室访问之前，研究人员打开信封并将参与者分配到应激组或对照组。在产前实验室访问中被随机分配到应激组的参与者在产后实验室访问中被分配到对照组，反之亦然。参与者对分组分配不知情，也不知道不同的组治疗。在产后十二周的测量 session 中进行 debriefing。

应激：应激组的母亲参加Trier社会应激测试（TSST，Kirschbaum et al., 1993）。该实验室应激测试已被证明在大多数参与者中有效产生应激反应（Gunnar et al., 2021）。参与者被指示进行一个五分钟的演讲，作为候选人在评委面前介绍自己 dream job。在5分钟的准备时间后，参与者被带到一个房间，墙上有一个大屏幕，评委通过在线会议实时 present。两名（女性）法官，穿着白大褂，不给予 verbal 或 facial 反馈。演讲后，评委提供心算任务的说明，也持续5分钟。参与者未被告知此部分任务的持续时间。表现由 visible video camera 记录。演讲和心算任务后，参与者被研究人员指示单独等待，而评委私下讨论他们的表现。此等待持续5分钟。当研究人员回来并告诉参与者评委已积极评价她的表现时，TSST完成。之后，母亲与婴儿团聚。TSST为当前研究 slightly modified 如下：(1) 因为母亲可能在约±8周前分娩 related physical complaints，参与者 seated instead of standing，和(2) 因为COVID-19 regulations，评委在线。TSST的在线版本已被证明有效诱导应激（Gunnar et al., 2021; Meier et al., 2022）。

控制：对照组的参与者， while being seated，完成一份关于不同织物的纸质问卷（例如，牛仔布、蕾丝），在任务期间提供触摸和检查（van Strien et al., 2014）。任务在与TSST相同的房间进行。然而，参与者不被评委观察，房间里没有 video camera。参与者被告知任务将持续10分钟，但不需要 keep an eye on the time，因为研究人员会在任务结束时回来。与应激组类似，参与者有5分钟准备此任务 by reading the instructions，并被要求任务后等待5分钟， before reunion with their infant。

结果

自然主义研究

初步分析显示，早晨、下午和晚上的全局情感水平彼此正相关（所有 r > 0.41）。较高的乳汁皮质醇与每个评估时刻较高的乳汁皮质酮相关（所有 r > 0.53）。相比之下，早晨、下午和晚上测量的乳汁皮质醇仅 weakly 或不相关。乳汁皮质酮和CC-ratio也是如此。全局情感与相同时刻的乳汁皮质醇、皮质酮或CC-ratio不相关，除下午更多的全局情感与增加的乳汁皮质酮 weakly 正相关。

主要回归分析结果显示，自我报告的全局情感与早晨、下午和晚上的MGCs（即皮质醇和皮质酮）没有关联（所有 p-values ≥ 0.19）。探索性回归分析显示，全局情感应激与早晨、下午和晚上的CC-ratio没有关联（所有 p-values ≥ 0.53）。

实验研究

描述性统计和实验室访问期间的应激反应表明，应激组的参与者在Trier社会应激测试期间显示出显著更高水平的全局情感（即VAS2和VAS3； both p-values < 0.01）和唾液皮质醇（即T2和T3； respectively p = 0.01和p < 0.01） compared to the control group。

回归分析结果表明，应激组的参与者显示出显著更高的乳汁皮质醇和皮质酮 compared to the control group（ both p-values = 0.02）。心理健康症状不调节组对MGCs的影响。同样， irrespective of group，实验室访问期间更高的唾液皮质醇反应性与增加的应激后MGCs强烈相关，而更高的全局情感反应性似乎与乳汁皮质醇或皮质酮无关，尽管我们确实发现与心理健康症状的显著交互效应（ Figure 5）。即，全局情感反应性与乳汁皮质酮之间的正相关似乎仅存在于心理健康症状相对较少的母亲中。确实，对于心理健康症状最高四分位数的女性，全局情感反应性与乳汁皮质酮之间关联的斜率不显著（p = 0.46），而心理健康症状最低四分位数的女性的斜率 marginally significant（p = 0.06）。

探索性分析表明，应激组的参与者具有显著更高的CC-ratio compared to the control group（ Figure 4）。此外，更高的唾液皮质醇反应性与增加的CC-ratio显著相关，而全局情感反应性与CC-ratio无关。用产后特定心理健康症状代替一般心理健康症状作为调节因子重复主要和探索性分析，未显示显著的交互效应（所有 p-values ≥ 0.21）。

讨论

本研究首次表明，暴露于急性心理社会应激源（即TSST）会导致人类应激后MGCs增加。这些发现与动物研究一致，后者发现（人工）应激诱导后乳汁糖皮质激素增加。同样，我们发现， irrespective of group，实验室访问期间更高的唾液皮质醇反应性与增加的应激后MG相关，这与先前研究一致，表明乳汁皮质醇来源于母体循环。当前研究通过发现应激源暴露与MGCs（包括CC-ratio）之间的因果联系证据，为该领域增添了内容。需要 replication studies。

由于MGCs被婴儿摄入，未来研究的一个重要问题是MGCs是否对儿童发育施加长期编程效应，如果是，这些效应的性质是什么。确定母体暴露于（慢性）应激源是否以及如何影响这些潜在编程效应也令人感兴趣。这些效应可能通过肠道吸收发生，影响肠道成熟，或通过穿越肠道屏障进入 bloodstream， where MGCs may exert systemic effects。确实，先前对动物和人类的研究发现了MGCs与后代 outcomes 之间联系的初步证据。此外，乳汁中较高的皮质醇浓度与婴儿气质差异相关。然而，其他研究未发现乳汁皮质醇的编程效应，更重要的是，乳汁皮质酮的潜在效应甚至 less understood，因为缺乏检查此的研究。因此，我们对MGCs和CC-ratio变异的潜在长期发育意义的理解仍然是推测性的，需要未来研究。此外，未暴露于MGCs（即当用配方奶粉喂养而不是母乳时）对儿童发育的潜在影响也仍然未知。

此外，我们发现心理应激与MGCs之间关联的证据很少。更具体地说，在自然主义研究中，当前全局情感与MGCs没有关联。由于来自此低风险样本的母亲报告平均低水平的全局情感，自然波动中的较轻应激可能不会导致MGCs的可检测差异。这得到先前研究的支持，包括Vacaru et al.（2023）最近的工作，后者显示健康社区样本中的母亲心理健康症状不能预测在家采集的乳汁皮质醇浓度。低全局情感水平也可能来自母乳喂养的放松效应。即，母乳喂养与母亲的心理和生理适应相关，例如减少焦虑和皮质醇水平，这与循环催产素水平相关。

然而，较轻应激可能不会导致MGCs可检测差异的推理不适用于我们实验研究中的发现，其中母亲显示出对TSST的预期心理反应，并报告了与自然主义研究相比显著更高水平的全局情感。然而， again we did not observe a main effect of self-reported global affect reactivity on post-stressor MGCs or the CC-ratio。由于 absence of evidence is not the same as evidence of absence，需要未来研究 with larger samples 来澄清心理应激（反应性）与MGCs之间是否存在联系，或没有。

重要的是，心理应激与MGCs之间的关系可能仅在一个特定亚组中 evident——那些没有面临心理健康症状的人。即，在我们的实验研究中，我们发现更高的全局情感反应性仅与心理健康症状水平低的母亲中增加的乳汁皮质酮相关。此发现不支持我们的假设，即具有高水平心理健康症状的母亲会有更高的HPA轴反应性。然而，由于我们在乳汁皮质醇或CC-ratio的分析中未发现类似的心理健康症状调节，HPA轴功能失调不太可能解释这些发现。心理健康症状调节的另一个可能解释可能是，具有高和低心理健康症状的母亲在乳汁采样时间上存在差异，因为实验室程序可能受到其心理状态的影响，包括放松、专注或焦虑。采样时间的变化可能潜在地影响MGCs测量， given that the cortisol to cortisone conversion by the enzyme 11β-HSD2 likely peaks about 15分钟 post-stressor，如在唾液中所见。然而，此解释似乎不太可能，因为事后分析显示乳汁采样时间与心理健康症状水平之间没有关联。也可能，长期暴露于心理健康症状可能通过不同机制影响乳汁皮质醇和皮质酮浓度，因为心理健康症状似乎也减少了母乳喂养期间催产素释放后的放松效应。需要进一步研究来复制我们的发现，并澄清MGCs和CC-ratio如何受母体全局情感反应性和心理健康问题的影响。一个包括MGCs基线采样的 within-person 研究设计可以阐明这些问题，这是研究2的最初意图。然而，考虑到目标人群（有非常年幼婴儿的母亲）的脆弱性和COVID-19大流行，要求实验室访问尽可能短， adding an additional milk sample to the protocol was considered unfeasible。此外，一个评估产后低风险样本中全范围心理健康症状的工具可以有助于更有效地反映心理健康状况，并减少由于多个问卷引起的参与者负担。

结论

总之，本研究表明，暴露于急性实验室应激源会导致乳汁皮质醇、皮质酮和皮质醇与皮质酮比值的增加。类似地，在更高的唾液皮质醇反应性情况下，观察到更高的MGCs浓度和更高的CC-ratio。然而，我们发现全局情感（反应性）与MGCs和CC-ratio关联的证据很少。仅当考虑过去一周的心理健康症状时，乳汁皮质酮与全局情感反应性相关。此结果需要进一步调查，包括对HPA轴功能的研究，以阐明急性和慢性应激之间的相互作用及其对MGCs的影响。 larger studies 对于调查影响乳汁糖皮质激素（MGC）浓度的因素、它们与母体急性和日常应激的相互作用以及它们对后代 outcomes（如肠道成熟和行为发育）的影响至关重要。理解母体、婴儿和环境因素如何塑造MGC水平特别重要，因为配方奶粉喂养的婴儿不暴露于这些生物活性化合物。此类研究对于揭示MGCs对儿童健康和发育的潜在适应性和非适应性短期和长期效应至关重要。