市售水凝胶增强电化学绷带产过氧化氢（H2O2）抗菌活性及其在感染伤口管理中的应用研究

本研究创新性地评估了六种市售临床水凝胶与产过氧化氢（H2O2）电化学绷带（e-bandage）的兼容性，证实通过调控水凝胶组分和含水量可显著增强其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和鲍曼不动杆菌生物膜的杀菌效能，为推进电化学抗菌敷料的临床转化提供了关键实验依据。

　　

1 引言

慢性伤口是指无法完成正常愈合过程的创面，通常需要长期护理。这类伤口可能由压力性损伤、糖尿病以及静脉或动脉功能不全引起。糖尿病患者和体重指数较高者发展慢性伤口风险增加。据统计，约2.5%的美国人口受慢性伤口影响，全球伤口护理市场预计在2023至2030年间以4.61%的速度增长。治疗糖尿病足伤口和静脉溃疡的年费用在美国约为100–150亿美元。患者可能经历疼痛、身心困扰、活动能力下降和/或社会隔离。

当皮肤损伤发生时，来自皮肤微生物群和/或污染物质的细菌会定植于伤口。虽然免疫反应通常能控制定植细菌，但如果伤口愈合延迟和/或存在致病微生物，则可能出现临床显著感染。引起伤口感染的病原体包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和念珠菌（Candida） species等。这些微生物在坏死组织上形成生物膜。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）是一个特殊挑战；同样，抗生素耐药鲍曼不动杆菌可在医院环境中繁殖，并引起2%的重症监护病房获得性皮肤/软组织感染。

过氧化氢（H₂O₂）是一种活性氧（ROS），可导致DNA损伤和膜脂质过氧化，改变膜电位并氧化含硫醇蛋白，从而导致细胞死亡。H₂O₂是一种广谱防腐剂，靶向细菌和真菌。中性粒细胞和巨噬细胞产生并利用H₂O₂清除定植于伤口床的细菌；这种杀菌剂也是参与伤口愈合过程的信号分子。因此，利用H₂O₂治疗和预防伤口感染，包括由抗生素耐药细菌引起的感染，引起了人们的兴趣。

为此，一种产H₂O₂的电化学绷带（e-bandage）正在被开发用于伤口感染的预防和治疗以及伤口愈合。e-bandage是一个电化学系统，具有工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE），当在?0.6 V_Ag/AgCl下操作时，通过氧的部分还原持续产生低浓度H₂O₂（O₂ + 2H⁺ + 2e^? ? H₂O₂ E⁰ = +0.085 V_Ag/AgCl）。电极浸泡在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并通过棉织物层和水凝胶分离。含有水和离子（如Na⁺、Cl^?）的水凝胶提供电解质来源。

除了作为电化学系统的组成部分外，对于伤口治疗，水凝胶提供了生物相容性以及e-bandage与伤口之间的连接。与传统的干燥电极材料不同，水凝胶富含水和离子的组成类似于生物组织，实现了机械和离子兼容性、导电性、灵活性甚至对外部刺激的响应性。许多市售水凝胶用于伤口愈合和感染预防。水凝胶可通过其高含水量和基于聚合物选择和交联方法的可定制特性，创造湿润和冷却环境来支持伤口愈合。市售产品包括用于药物输送和组织工程的烯烃聚合物基、交联亲水性和纤维素基水凝胶，以及由聚乙二醇/聚酯嵌段共聚物制成的具有刺激响应功能的水凝胶，用于愈合特性、控制药物释放和/或传感。虽然水凝胶中使用的一些化学物质可能有副作用（例如皮肤腐蚀/刺激、皮肤敏化），但许多被认为是安全的，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于人类——例如，使用3M水凝胶未见不良反应报告。产H₂O₂的e-bandage正在开发用于人类，理论上可以与临床使用的水凝胶一起部署。然而，临床使用的水凝胶尚未在电化学系统中测试，其在此类应用中的适用性尚未确定。

这项工作的目标是确定市售、FDA批准的临床水凝胶是否可以与产H₂O₂的e-bandage集成。本研究评估了市售水凝胶对e-bandage针对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978生物膜的杀菌活性的影响。使用先前描述的1.77 cm² e-bandage与六种市售水凝胶（3M、Duoderm、Prontosan、Purilon、Skintegrity和Solosite）进行了评估，这些水凝胶添加了0.9% NaCl以电化学操作e-bandage，并与黄原胶水凝胶（先前e-bandage评估中使用）作为对照。其中一种市售水凝胶——3M水凝胶——也测试了添加水含量以评估此修改对杀菌活性的影响，因为更高的水含量预计会增强水凝胶内的离子迁移率，同时保持有利于伤口愈合的湿润环境。由于市售水凝胶中的化学物质可能溶解e-bandage碳织物粘合剂基质，测试了两种对电极（CE）材料（Elat和Panex）。验证使用FDA批准的临床水凝胶和两种不同电极材料的e-bandage操作预计将推动该技术向人类临床应用迈进。

2 实验部分

2.1 电化学绷带（e-bandage）

e-bandage的构建、应用和细节在以前的出版物中有涵盖。e-bandage是一个电化学系统，由三个电极组成：两层碳织物作为工作电极（WE，1.77 cm²，Panex 30 PW-06，Zoltek Companies Inc.）和作为对电极（CE，Panex或Elat-产品代码：1591001，Fuel cell store，USA），以及一根银/氯化银（Ag/AgCl）线作为准参比电极（QRE）。电极通过三层棉织物（每层2.25 cm²）分离，并使用硅胶粘合在一起。通过30 AWG钛线（TEMco，Amazon.com，目录号RW0517）与尼龙缝制按扣（Dritz，Spartanburg，SC，物品号85）压接建立电连接，将碳织物电极连接到恒电位仪电缆（Interface 1010T/Interface 1000，Gamry）与多路复用器（IMX8/ECM8，Gamry）。WE和CE覆盖有水凝胶以确保电化学连接。实验前，e-bandage在PBS中浸泡约15分钟，并在层间添加水凝胶（100 μL）以确保所有组件充分覆盖。

2.2 水凝胶制备

研究了3M（3M，US）、Duoderm（Convatec，UK）、Prontosan（Bbraun Medical Inc.，Germany）、Purilon（Coloplast，Denmark）、Skintegrity（Medline Industries，US）和Solosite（Smith & Nephew Medical Limited，US）水凝胶。每100克这些水凝胶中添加了0.76克NaCl。购买的水凝胶成分如表1所示。

PBS溶液通过将Na₂HPO₄（0.01 M）、KH₂PO₄（0.0018 M）、NaCl（0.137 M）和KCl（0.0027 M）溶解在18 MΩ cm去离子水（1 L）中制备。黄原胶（Namaste Foods，Amazon.com，UPC：301155217160）水凝胶由1× PBS与黄原胶（1.8% [wt/vol]）混合制成。3M衍生水凝胶的制备如表2所述。所有水凝胶在121°C下液体循环条件下高压灭菌15分钟。

2.3 体外琼脂膜生物膜模型

使用了一种模拟伤口床的琼脂伤口生物膜模型。评估了产H₂O₂ e-bandage对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978的抗生物膜活性，这些物种通常与伤口生物膜感染相关。对于体外琼脂膜生物膜模型，每个分离物从冷冻库存（?80°C）划线分离到胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）平板上，并在37°C培养24小时。然后使用菌落接种2 mL胰蛋白酶大豆肉汤（TSB），在37°C、150 rpm下培养直至达到0.5 McFarland浊度（约50分钟）。然后，将2.5 μL的0.5 McFarland培养物点种在位于TSA平板上的紫外线灭菌13 mm聚碳酸酯膜（Whatman Nuclepore polycarbonate亲水膜，Cytiva编号10417001）中心。接种的膜在37°C培养24小时以建立生物膜。

2.4 e-bandage处理

将24小时琼脂生物膜转移到新鲜的TSA平板上。使用注射器针头将水凝胶（100 μL）放置在e-bandage的棉织物层之间，QRE位于此处。将水凝胶（100 μL）放置在生物膜顶部，并将e-bandage放置在水凝胶顶部，WE侧与生物膜侧接触用于非极化和极化组。然后在e-bandage顶部再放置100 μL水凝胶。使用无菌Tegaderm透明薄膜（3M，参考号1622W）覆盖e-bandage。e-bandage导线粘贴到TSA平板侧面。然后将盖子放在TSA平板上，并用parafilm包裹平板。每个e-bandage连接到恒电位仪（Interface 1010T/Interface 1000，Gamry）与多路复用器（IMX8/ECM8，Gamry）。将WE极化至?0.6 V_Ag/AgCl以在WE表面产生H₂O₂。非极化（对照；不产生氧化剂）条件使用相同设置但不极化。检查了不同水凝胶与电化学产生H₂O₂的e-bandage对MRSA IDRL-6169或鲍曼不动杆菌ATCC 17978琼脂膜生物膜的影响。生物膜处理24小时（极化组）。

2.5 生物膜定量

从TSA平板上移除e-bandage并放入无菌培养皿中。将生物膜从WE表面刮入PBS（5 mL）中。将PBS溶液和膜转移到15 mL离心管中，涡旋2分钟并在50 Hz下超声处理10分钟。随后，通过以2910相对离心力离心10分钟将细胞沉淀，并重悬于1 mL PBS中。最终1 mL重悬液进行系列稀释（10倍），并将每种稀释液10 μL点种在TSA上，在37°C培养过夜。24小时后计数菌落形成单位（CFU）。

2.6 统计分析

数据显示为至少四个生物学重复（即在不同日期进行的实验的结果）的个体数据点，带有标准偏差。使用Wilcoxon秩和检验进行组间比较。选择非参数检验。所有检验均为双尾，统计显著性考虑p值低于0.05。使用GraphPad Prism（GraphPad Software 10.4.1）进行统计分析和图表生成。

3 结果

为了评估市售水凝胶与e-bandage的兼容性，测试了定制制备的3M衍生和黄原胶水凝胶与产H₂O₂ e-bandage和水凝胶减少MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978体外负荷的能力。此外，为了评估e-bandage与不同CE材料（Elat和Panex碳织物）的兼容性，使用所有水凝胶进行了测试。

3.1 市售水凝胶对MRSA IDRL-6169生物膜的活性

图2和图3显示了使用Panex和Elat碳织物作为CE时，e-bandage与六种市售水凝胶和黄原胶对MRSA IDRL-6169生物膜的活性。

由于先前研究使用黄原胶操作e-bandage，因此将其用作对照。使用黄原胶水凝胶的极化Panex CE构建e-bandage显示，与未极化e-bandage相比，MRSA IDRL-6169负荷显著减少（p < 0.01，图2g）；初始和未极化e-bandage组之间没有减少，表明黄原胶本身不影响MRSA IDRL-6169数量。黄原胶（对照水凝胶）与极化e-bandage导致MRSA IDRL-6169细菌负荷减少类似（约3–4 log₁₀[CFU/cm²]），与我们之前的研究一致。使用3M、Duoderm和Solosite水凝胶的极化Panex CE构建e-bandage显示出与黄原胶类似的效果（图2a,b,f）。Prontosan和Skintegrity水凝胶单独与未极化e-bandage导致MRSA IDRL-6169相比初始数量减少，暗示这些水凝胶可能具有独立的杀菌活性（p < 0.05，图2c,e）。有趣的是，Prontosan还在未极化和极化Panex CE构建e-bandage处理之间导致减少（p < 0.05），而Skintegrity没有。最后，当Panex CE构建e-bandage与Purilon使用时，初始和极化组之间存在细菌负荷差异（p < 0.05），但未极化和极化组之间没有，表明Purilon水凝胶可能不适合Panex CE构建e-bandage使用（图2d）。考虑Panex CE构建极化（活性）e-bandage与六种不同水凝胶处理24小时后对MRSA IDRL-6169的平均log₁₀(CFU/cm²)值，活性按以下顺序降低：黄原胶（6.09 ± 1.24 log₁₀[CFU/cm²]）、3M（6.15 ± 1.27 log₁₀[CFU/cm²]）、Solosite（6.6 ± 0.64 log₁₀[CFU/cm²]）、Prontosan（7.34 ± 0.28 log₁₀[CFU/cm²]）、Skintegrity（7.37 ± 1.03 log₁₀[CFU/cm²]）、Duoderm（7.95 ± 0.36 log₁₀[CFU/cm²]）和Purilon（8.17 ± 0.26 log₁₀[CFU/cm²]）（图2）。

对于使用黄原胶的Elat CE构建e-bandage，未极化和极化e-bandage组之间MRSA IDRL-6169显著减少（p < 0.05）；初始和未极化e-bandage log₁₀(CFU/cm²)之间也存在差异（p < 0.05，图3g）。3M、Prontosan、Purilon和Solosite水凝胶的活性与CE材料无关（图2a,c,d,f和图3a,c,d,f）。与Panex CE构建e-bandage不同（图2b），使用Duoderm水凝胶的Elat CE构建e-bandage未显示未极化和极化组之间的统计学显著差异（图3b）。使用Skintegrity水凝胶的Elat CE构建e-bandage在比较初始和极化组时未证明显著细菌减少（图3e）。无论CE材料如何，当使用Skintegrity水凝胶对抗体外MRSA IDRL-6169生物膜时，未极化和极化e-bandage组之间没有显著差异。考虑Elat CE构建e-bandage与水凝胶处理24小时后对MRSA IDRL-6169的平均log₁₀(CFU/cm²)值，活性按以下顺序降低：Solosite（6.39 ± 1.27 log₁₀[CFU/cm²]）、Duoderm（6.97 ± 0.80 log₁₀[CFU/cm²]）、Prontosan（7.36 ± 0.27 log₁₀[CFU/cm²]）、Skintegrity（7.40 ± 0.96 log₁₀[CFU/cm²]）、黄原胶（7.46 ± 极化组相比初始或未极化组（p < 0.05），而初始和未极化组之间无显著差异（图4a,c,e,g）。此外，当对照水凝胶黄原胶极化时，观察到鲍曼不动杆菌ATCC-17978生物膜减少（约5 log₁₀[CFU/cm²]），与先前发现一致。使用3M或Prontosan的Elat CE构建e-bandage未改变杀菌活性（图5a,c） compared to Elat CE-constructed e-bandages。然而，对于Skintegrity和黄原胶水凝胶，将CE从Panex更改为Elat改变了活性，仅在比较极化组与初始或未极化组时发现显著差异（p < 0.05，图5e,g）。最后，Purilon水凝胶操作的e-bandage在任何测试组之间未显示任何显著差异，无论CE材料如何（图4d和图5d），暗示Purilon水凝胶可能不适合用于对抗鲍曼不动杆菌ATCC-17978的e-bandage使用。

考虑Panex CE构建e-bandage与六种市售水凝胶处理24小时后对鲍曼不动杆菌ATCC-17978的平均log₁₀(CFU/cm²)值，活性按以下顺序降低：Solosite（2.74 ± 1.72 log₁₀[CFU/cm²]）、Duoderm（2.81 ± 1.86 log_{10Max水凝胶对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978生物膜的表现至少与市售3M水凝胶同样有效。}

3.4 增加3M水凝胶的水含量提高e-bandage对鲍曼不动杆菌ATCC 17978生物膜的活性

图7显示了当e-bandage与Panex和Elat碳织物作为CE使用时，3M和3M衍生水凝胶对鲍曼不动杆菌ATCC 17978的活性。使用市售3M、3M_Max或3M_Med水凝胶的Panex CE构建e-bandage在比较极化组与初始或未极化组时均显示细菌数量减少（p < 0.05），初始和未极化组之间无显著差异。使用3M_Min水凝胶的Panex CE构建e-bandage在比较极化组与初始或未极化组时未显示细菌负荷的显著变化；然而，Elat CE构建e-bandage在比较未极化和极化组时表现出增强的活性，唯一的变化实例发生在初始和未极化组之间（原因未知）。当比较使用3M_Max、3M_Med和3M_Min水凝胶的极化组与使用市售3M水凝胶的组时，无论CE材料如何，使用3M_Min的e-bandage对鲍曼不动杆菌ATCC-17978的活性较低（p < 0.05）。与市售3M水凝胶相比，3M_Med水凝胶也显示支持e-bandage活性的能力降低，但仅在使用Elat CE构建e-bandage时（p < 0.05）。无论使用Panex还是Elat作为CE，3M_Max水凝胶对MRSA IDRL-6169和鲍曼不动杆菌ATCC 17978生物膜的表现至少与市售3M水凝胶同样有效。

4 讨论

水凝胶在医学中有许多应用。它们可以在组织-电极界面提供生物力学整合。人体由各种柔软、高度水合的组织组成，而e-bandage由碳纤维和干燥电极组件组成。两个表面之间的差异需要使用水凝胶以确保e-bandage的有效电化学活性。多种市售水凝胶可潜在地用于个体化患者治疗。先前，一个原型1.77 cm² e-bandage被设计用于伤口护理（在小鼠中），其功能取决于涂覆水凝胶。考虑到可用水凝胶产品的广度，本研究侧重于e-bandage与六种市售水凝胶之一操作时的功能，并评估了一种水凝胶的差异水合作用。

4.1 市售水凝胶在e-bandage应用中的杀菌活性

3M水凝胶由丙二醇、瓜尔胶和四硼酸钠制成，提供湿润的愈合环境以增强伤口愈合。3M水凝胶操作的e-bandage在使用Panex（p < 0.01 vs. 初始和未极化）或Elat（p < 0.05 vs. 初始和未极化）作为CE时，对MRSA生物膜 demonstrate 显著减少细菌负荷。此外，使用两种CE组成，对鲍曼不动杆菌生物膜观察到显著减少（p < 0.05 vs. 初始和未极化）。

Duoderm水凝胶包含羧甲基纤维素基质，常用于伤口愈合，包括作为许多伤口愈合研究的阳性对照。在本研究中，Duoderm水凝胶操作的e-bandage减少了MRSA和鲍曼不动杆菌生物膜（p < 0.05 vs. 初始或未极化）。

Prontosan水凝胶包含甜菜碱和聚氨基丙基双胍（聚己脒，PHMB）。甜菜碱是一种表面活性剂，可能改变细菌表面，导致生物膜和伤口碎片去除。据报道，PHMB对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌以及真菌具有抗菌活性。与这些报告一致，本研究结果表明，负载Prontosan水凝胶的未极化e-bandage对MRSA IDRL-6169生物膜显示抗菌活性（p < 0.05 vs. 初始和未极化）（图2和图3）。然而，当用于操作产H₂O₂的e-bandage时，其对MRSA和鲍曼不动杆菌生物膜的活性增加，导致与初始条件和未极化组相比，这些细菌显著减少（p < 0.05）。

Purilon水凝胶由羧甲基纤维素钠和藻酸钙组成。藻酸盐用于生物医学科学，特别是在组织工程中，包括骨和软组织， due to its biocompatibility and gel formation properties。在进行的Purilon水凝胶实验中，e-bandage对MRSA或鲍曼不动杆菌生物膜的活性有限。处理导致MRSA生物膜减少（p < 0.05 vs. 初始）但对鲍曼不动杆菌未显示显著效果，即使使用不同的CE材料。电化学结果表明，Purilon水凝胶表现出与其他水凝胶不同的行为。它在绷带处理前测量的所有测试水凝胶中具有最高的未补偿电阻（Ru）（表S1）。考虑24小时H₂O₂处理后水凝胶的Ru值，与初始值相比观察到显著下降，表明系统在极化下达到稳定平衡。这表明观察到的电阻减少与极化诱导的电化学活性相关。此外，与其他测试水凝胶不同，法拉第电流随时间减少；然而，在Purilon水凝胶负载H₂O₂ e-bandage处理期间（图S1）。

Skintegrity水凝胶由尿囊素、羟乙基纤维素和葡聚糖组成。虽然尿囊素提供水分，羟乙基纤维素是一种增稠、稳定和乳化剂，葡聚糖可以增强水分保留、改善生物相容性并提供伤口愈合支架。因此，这种水凝胶可能提供伤口水合作用并促进愈合。即使使用Skintegrity水凝胶的e-bandage未极化，它对MRSA生物膜也显示抗菌活性（p < 0.05 vs. 初始）。它也与产H₂O₂的e-bandage一起工作。当使用Panex而非Elat作为CE时，它对MRSA具有杀菌活性（p < 0.05 vs. 初始）。鲍曼不动杆菌生物膜在使用Skintegrity水凝胶操作的产H₂O₂ e-bandage下显著减少（p < 0.05） compared to the initial condition and the nonpolarized e-bandages。

Solosite的活性成分包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、尿囊素和苯甲醇。对羟基苯甲酸酯提供广谱抗菌活性，而尿囊素提供皮肤舒缓、保湿和愈合特性。苯甲醇在药品和化妆品中用作防腐剂以阻止微生物生长。Solosite被证明在大鼠实验性诱导烧伤伤口的愈合中提供有益结果。在本研究中，Solosite是与产H₂O₂的e-bandage一起使用时最有效的水凝胶，对MRSA实现约2 log₁₀(CFU/cm²)的细菌减少（p < 0.05），对鲍曼不动杆菌实现约6 log₁₀(CFU/cm²)的减少（p < 0.05） compared to initial or nonpolarized groups。

在极化e-bandage应用下观察到的水凝胶之间抗菌活性的差异假定与水凝胶组成及其在极化条件下的电化学行为相关。虽然这可以通过执行潜在反应产物的详细化学分析和/或解构水凝胶的详细分析来探索，但这样做超出了当前工作的范围。

4.2 定制水凝胶用于增强e-bandage活性的评估

制备并测试了黄原胶和定制制造的3M水凝胶与e-bandage。黄原胶没有独立的抗菌活性，但表现出优异的水溶性和生物相容性，使其对皮肤无毒且无刺激。它提供有益的保湿环境并支持伤口愈合。如先前工作所示，黄原胶与产H₂O₂的e-bandage兼容，当使用Panex（p < 0.01 vs. 初始和未极化）或El