苔藓光生物反应器中HPV-16病毒样颗粒的成功生产：非维管植物疫苗研发的重大突破

为解决HPV疫苗生产平台的局限性，研究人员利用苔藓植物小立碗藓（Physcomitrella）光生物反应器系统，成功实现人乳头瘤病毒16型（HPV-16）主要衣壳蛋白L1的高效表达，产量达0.3 mg/g FW，并通过体外重装配获得结构完整的病毒样颗粒（VLPs），为植物分子农业生产疫苗候选物提供了新策略。

　　

人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）感染是引发宫颈癌、肛门生殖器癌和口咽癌等多种恶性肿瘤的主要病因，其中HPV-16和HPV-18型别导致了绝大多数相关癌症。病毒样颗粒（Virus-like Particles, VLPs）作为一类不含病毒遗传物质、无感染性但保留病毒表面结构和免疫原性的纳米颗粒，已成为预防性疫苗和药物递送系统的重要平台。目前HPV疫苗主要采用酿酒酵母、大肠杆菌或杆状病毒-昆虫细胞系统生产，但这些系统在糖基化修饰、生产成本和规模化方面存在一定局限。因此，开发新型高效、低成本且易于规模化的VLP生产平台具有重要科学意义和实际应用价值。

苔藓植物小立碗藓（Physcomitrella patens）作为一种新兴的植物生物反应器系统，具备诸多独特优势：其拥有高效的同源重组能力，便于精确基因编辑；已成功实现人源化N-糖基化修饰，可避免植物特异性糖基化引起的免疫原性问题；还可在光生物反应器中实现符合药品生产质量管理规范（GMP）的大规模培养。尽管此前已有研究利用本氏烟（Nicotiana benthamiana）等植物系统表达HPV L1蛋白，但非维管植物中VLP的生产尚未见报道。

在该研究中，研究人员通过多种关键技术开展实验。他们利用人 codon 优化序列（hL1）为模板，进行小立碗藓特异性优化（physCO），获得pL1序列；从苔藓N-末端组数据库筛选并验证了5种叶绿体转运肽（CTP），最终选择CTPc5用于L1的叶绿体靶向；构建了三种L1变体（pL1、pL1△22、CTP-pL1）并利用荧光蛋白融合技术验证其亚细胞定位；在5升光生物反应器中开展放大培养，并加入植物激素NAA诱导表达；建立硫酸铵沉淀和阳离子交换色谱两步纯化流程；通过透射电子显微镜（TEM）和点杂交分析VLP组装状态。

研究首先通过序列优化消除潜在剪接位点和microRNA结合位点，获得pL1编码序列。利用Confocal激光共聚焦显微镜证实，融合HPV-16天然核定位信号（NLS）的pL1定位于细胞核，而去除NLS的pL1△22分布于细胞质，CTP-pL1则成功靶向叶绿体。Western blot分析显示，叶绿体靶向的CTP-pL1表达量显著高于其他两种变体，最高达到142 μg/g FW（鲜重）。在5升光生物反应器中，通过添加5 μM NAA（萘乙酸），L1产量在第7天达到峰值332 μg/g FW，较初始水平提高130%。

研究人员建立了基于45%硫酸铵沉淀和阳离子交换色谱的纯化流程，有效去除了大部分宿主蛋白。点杂交实验使用CamVir1（识别线性表位）和H16.V5（识别构象表位）抗体证实，从粗提物到纯化样品中均存在构象完整的L1蛋白，表明在体内或提取过程中已形成至少五聚体（capsomer）结构。透射电镜结果显示，纯化后的L1样品经体外解离-重装配处理，成功形成直径约60 nm的病毒样颗粒，其形态和大小与酵母生产的VLPs相似，但存在一定异质性和聚集倾向。

该研究首次在非维管植物中成功生产、纯化并装配HPV-16 L1病毒样颗粒，产量达到应用级别，证明了小立碗藓作为VLP生产平台的可行性。研究还系统评估了多种叶绿体转运肽的效率，建立了针对叶绿体靶向表达的最佳策略，为复杂疫苗抗原的植物生物反应器生产提供了重要技术支撑。该平台不仅适用于非包膜VLPs的生产，未来还有望扩展到需要精确糖基化修饰的包膜病毒样颗粒（eVLPs）等更复杂疫苗候选物的生产，为疫苗研发和生物制药领域提供了新的技术路径。研究成果发表于《Plant Cell Reports》，为植物分子农业在医疗健康领域的应用开辟了新的方向。