未解决的内质网应激限制甘蓝型油菜小孢子体外细胞全能性

本研究针对植物细胞体外再生过程中内质网应激（ER stress）的关键作用展开探索。研究人员通过热激（HS）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA）处理甘蓝型油菜小孢子，发现不同胚胎发生结构在解决ER应激能力上存在差异，进而影响其发育潜能。研究表明，通过药物调控ER应激水平可显著提高胚胎产量，揭示了组蛋白去乙酰化（HDAC）通过调控应激反应参与细胞全能性建立的新机制，为作物遗传改良提供了新思路。

　　

在植物生物学领域，细胞全能性（totipotency）是指单个细胞发育成完整有机体的潜能，这一特性在植物组织培养和遗传改良中具有重要应用价值。其中，小孢子胚胎发生（microspore embryogenesis, ME）是研究细胞全能性的经典模型，通过应激诱导本应发育成花粉的雄性配子体转向胚胎发育途径。然而，这一过程效率低下，只有少数小孢子能够成功形成完整胚胎，其调控机制尚不明确。近年来研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ER stress）作为细胞应对蛋白质折叠压力的重要反应，可能与细胞命运决定密切相关。

为深入探究ER应激在植物细胞全能性建立过程中的作用，研究人员以甘蓝型油菜（Brassica napus）为模型，开展了系统研究。该研究成果发表在《Plant Cell Reports》上，通过多学科方法揭示了ER应激响应与胚胎发育能力之间的内在联系。

研究采用的主要技术方法包括：利用热激（HS）和组蛋白去乙酰化酶抑制剂Trichostatin A（TSA）诱导小孢子胚胎发生；通过透射电子显微镜（TEM）观察细胞超微结构；使用DiOC₆(3)、ER-Tracker Green和Cytopainter ER等荧光染料进行内质网染色和共聚焦显微镜分析；应用流式细胞分选技术（FACS）分离胚胎发生结构进行转录组测序（RNA-seq）；以及使用衣霉素（tunicamycin, Tm）和4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate, 4-PB）等药物调控ER应激水平。

ER扩张和蛋白质填充的ER池是ER应激的超微结构特征

通过透射电子显微镜分析，研究人员发现所有类型的胚胎发生结构都表现出ER应激的超微结构特征，包括堆叠的ER池和充满蛋白质的肿胀ER池。这些特征在发育潜能较低的胚胎发生愈伤组织（compact callus, CC和loose callus, LC）中更为明显。定量分析显示，在HS+TSA_high处理中，超过70%的紧凑型和松散型愈伤组织表现出大量ER积累（>15%细胞面积），而外壁包裹胚胎（exine-enclosed embryos, EE）中仅约10%显示类似特征。

ER应激在发育潜能低的胚胎发生结构中放大

荧光染色结果表明，体外培养本身就能诱导ER积累，而TSA处理进一步增强了这种效应。在四天龄的培养物中，发育潜能低的胚胎发生愈伤组织比发育潜能高的外壁包裹胚胎和胚柄胚胎（suspensor-bearing embryos, SUS）表现出更高的ER应激水平。然而在八天龄培养物中，所有结构的DiOC₆染色都变得微弱且均匀，表明这些结构不再显示差异性的ER应激响应。

减轻ER应激提高胚胎产量

药理学实验证实了ER应激与胚胎发育能力之间的因果关系。衣霉素（Tm）处理加剧了ER应激并降低了所有处理条件下的胚胎产量。相反，分子伴侣4-苯基丁酸（4-PB）处理减轻了ER应激，并在HS、HS+TSA_low和HS+TSA_high处理中均提高了分化胚胎的产量。

胚胎发生结构和花粉的ER应激转录组分析

转录组分析显示，与体外花粉培养相比，HS+TSA处理的胚胎发生结构（主要由愈伤组织组成）中大多数ER应激相关基因的表达下调。这种下调在HS+TSA_high与HS+TSA_low处理之间没有明显的剂量依赖性，但HS+TSA_high处理中有更多基因出现统计学显著的下调表达。

研究表明，甘蓝型油菜胚胎发生小孢子中产生的ER体（ER bodies）可能是应对应激条件下错误折叠蛋白质积累的一种机制。这些结构与十字花科植物中描述的ER体相似，可能通过增加蛋白酶活性来处理应激反应中产生的大量错误折叠或未折叠蛋白质。

研究结果强调，ER应激水平与不同胚胎发生结构的发育能力呈负相关。发育潜能低的胚胎发生愈伤组织表现出更强的ER应激响应，而发育潜能高的外壁包裹胚胎和胚柄胚胎能够更好地解决ER应激。这种差异可能与这些结构在细胞壁组成、细胞粘附程度和外壁破裂方式等方面的已知差异有关。

值得注意的是，体外培养的花粉虽然也经历ER应激，但能够维持细胞稳态并完成发育，这可能与花粉本身具有较高的未折叠蛋白反应（unfolded protein response, UPR）组分基础水平有关，这些组分有助于解决组织培养中增加的ER应激。

关于组蛋白去乙酰化酶（HDAC）调控机制，研究表明HDAC不仅调控小孢子对胚胎发生的感应能力，还调节其应激响应。TSA作为Rpd3/Hda1家族的泛抑制剂，可能通过抑制多个HDAC蛋白来激活应激响应和全能性。其中HDA19被证明负调控热激响应，而HDAC6和HDA9正调控热激响应，HDA6和HDA19协同抑制幼苗的全能性，HDA19限制激素诱导的体细胞胚胎发生。

这项研究的重要意义在于揭示了未解决的ER应激是限制植物细胞全能性的关键因素，为提高作物遗传改良效率提供了新的理论依据。研究发现通过药理学手段减轻ER应激可以显著提高胚胎产量，这为优化植物组织培养体系提供了实用策略。同时，研究揭示了组蛋白去乙酰化在调控应激响应和细胞命运决定中的双重功能，拓展了表观遗传调控在植物发育生物学中的认知边界。这些发现不仅对植物细胞全能性研究具有重要启示，也为理解真核细胞应激响应与发育转变的普遍机制提供了宝贵见解。