静电纺丝纤维增强软质蜘蛛丝水凝胶：一种用于软组织工程的机械强化与细胞友好型复合材料

《Macromolecular Rapid Communications》：Fiber Reinforcement of Soft Spider Silk Hydrogels

本文推荐一种通过静电纺丝纤维增强低浓度重组蜘蛛丝水凝胶的新策略，成功解决了软组织工程中高细胞增殖活性与弱机械稳定性间的矛盾。该复合材料（fmhc）显著提升杨氏模量（E）一个数量级，同时保持优异生物相容性，为仿生细胞微环境设计提供创新方案。

　　

低粘度蜘蛛丝水凝胶中的细胞生长

研究首次系统比较不同浓度重组蜘蛛丝水凝胶对细胞行为的影响。使用表达荧光泛素化细胞周期指示器（FUCCI）的NIH/3T3成纤维细胞，通过红（G₁期）、绿（S/G₂/M期）荧光标记实时监测细胞周期进程。在1%（w/v）低浓度eADF4(C16)-RGD水凝胶中，细胞呈现更高比例的绿色（增殖期）和黄色（G₁/S转换期）细胞核，表明其增殖活性显著优于传统3%（w/v）高粘度水凝胶。但1%水凝胶存在明显缺陷：杨氏模量仅0.15 kPa，形状保真度低且操作困难，亟需机械强化策略。

纤维网格-水凝胶复合材料（fmhc）的制备

采用静电纺丝技术制备两种重组蜘蛛丝纤维网格：负电荷eADF4(C16)（平均直径244±67 nm）和正电荷eADF4(κ16)（平均直径309±81 nm）。经甲醇气相后处理诱导β-折叠晶体形成，确保纤维水稳定性。通过层层组装技术，将静电纺丝纤维网格与1%蜘蛛丝前体溶液（SSPS）交替堆叠，在37°C下凝胶7天形成多层复合材料。其中eADF4(C16)水凝胶与eADF4(C16)纤维组合称为fmhc_CC，与eADF4(κ16)纤维组合称为fmhc_CK。宏观稳定性测试显示，fmhc可成功桥接直径15 mm的聚乳酸（PLA）环孔，而纯水凝胶发生坍塌。

fmhc的形态学特征

扫描电镜（SEM）揭示复合材料超微结构：自组装纳米纤丝（3-8 nm）嵌入静电纺丝纤维网格孔隙中，形成三维网络。关键发现在于纤维表面呈现"刷状"纤丝锚定结构——eADF4(C16)纳米纤丝从静电纺丝纤维表面延伸生长，表明纤维表面可作为二级成核位点引发蛋白质自组装。值得注意的是，尽管表面电荷不同，eADF4(κ16)纤维同样呈现类似纤丝锚定现象，提示静电相互作用并非界面结合的主要机制，而物理缠结和表面成核效应主导纤维-水凝胶网络整合。

fmhc的力学性能测试

流变学振幅扫描显示：纯1%水凝胶线性粘弹区（LVE）仅至15%应变，而fmhc虽线性区缩短，但储能模量（G’）和损耗模量（G″）提高一个数量级。杨氏模量从纯水凝胶的0.15 kPa显著提升至fmhc_CC的1.81 kPa和fmhc_CK的1.76 kPa（p<0.05），两组间无统计学差异。这表明机械增强主要源于纤维网格的应力传递效应，而非静电作用。纤维网络作为韧性相嵌入水凝胶基质，有效提高刚度、断裂韧性和能量吸收能力，抑制裂纹扩展，使复合材料模量进入软组织匹配范围（1-3 kPa）。

fmhc的细胞相容性

为评估纤维增强对细胞行为的影响，在单层纤维网格增强的eADF4(C16)-RGD水凝胶表面接种FUCCI报告细胞。细胞周期相位比例与纯水凝胶无显著差异，表明纤维引入未改变增殖活性。培养24小时后，细胞在所有基质表面均呈现铺展形态并表达应力纤维，证实细胞相容性良好。细胞骨架染色（Phalloidin-red）和核染色（DAPI）显示，纤维网格嵌入未对细胞形态产生负面影响，维持正常细胞-基质相互作用。

实验方法创新

研究建立标准化制备流程：蜘蛛丝蛋白经6 M硫氰酸胍溶解后透析获得可溶性前体；静电纺丝在25 kV电压、4 μL/min流速、15-30%湿度条件下进行；多层组装采用凡士林密封技术防止溶液渗漏；临界点干燥和铂溅射处理保障SEM样品完整性；FTIR光谱结合傅里叶自去卷积（FSD）分析二级结构；流变学测试采用25 mm喷砂平行板几何结构，通过方程E=2G(1+ν)估算杨氏模量（泊松比ν取0.5）。

该研究通过仿生设计将微米级静电纺丝纤维与纳米级自组装纤丝网络结合，创建了具有分级结构的复合材料，不仅解决低浓度水凝胶机械性能弱的瓶颈问题，同时保留促进细胞增殖的微环境特性，为神经组织工程等软组织再生提供理想支架平台。