光笼释放一氧化氮实现血红素蛋白时间分辨串行晶体学的创新研究

本研究针对酶反应和信号传导过程中瞬态结构解析的难题，开发了一种基于光笼释放一氧化氮（NO）的时间分辨串行晶体学方法。研究人员通过优化N,N′-双(羧甲基)-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺（NO cage）的光解参数，在固定靶样品台上成功实现了细胞色素c′（McCP-β）和染料脱色过氧化物酶B（DtpB）从微秒到秒级时间分辨率的NO结合过程观测，为研究非光激活酶的反应动力学提供了重要技术平台，相关成果对揭示血红素蛋白的气体信号传导机制具有突破性意义。

　　

在结构生物学领域，捕捉蛋白质在酶反应、配体结合和信号传导过程中的瞬态结构始终是一项重大挑战。虽然串行晶体学技术的发展使得科学家能够通过光脉冲或混合微晶等方式启动反应，并在特定时间延迟后采集单帧衍射图像，从而构建生物过程的"定格动画"系列结构，但绝大多数酶反应无法被自然光激活，而混合方法又受限于底物在晶体中的扩散速率，通常只能达到毫秒级的时间分辨率。

为了解决这一技术瓶颈，研究人员将目光投向了光笼技术——通过光敏化合物释放目标分子来实现反应启动。在这项发表于《IUCrJ》的研究中，科学家们专注于一种能够释放一氧化氮（NO）的光笼系统，并选择两种血红素蛋白作为研究对象：来自甲基球菌的细胞色素c′β（McCP-β）和来自链霉菌的染料脱色过氧化物酶B（DtpB）。这两种蛋白质均为理解NO结合行为提供了理想模型：McCP-β在NO结合后会在血红素铁远端形成明确的电子密度变化；而DtpB则具有独特的"干燥"远端血红素口袋，便于NO的 straightforward 结合。

研究团队采用多技术联用策略：通过紫外-可见光谱验证了NO cage的光解特性；使用固定靶样品传输系统分别在钻石光源I24线站（SSX）和SACLA XFEL（SFX）进行时间分辨实验；利用PORTO飞秒脉冲激光系统（308 nm）实现光笼激活；通过分子置换和迭代精修解析晶体结构；采用B因子分析和F_o-F_c差值密度峰值高度量化等多种方法评估NO占据率。

在材料与方法方面，研究团队合成了NO光笼化合物N,N′-双(羧甲基)-N,N′-二亚硝基-1,4-苯二胺，并通过紫外-可见光谱验证其光解特性。分别表达了McCP-β和DtpB蛋白并制备了微晶体，通过预浸泡方式将光笼化合物引入晶体。使用固定靶芯片系统在钻石光源I24线站进行串行同步辐射晶体学(SSX)实验，在SACLA进行串行飞秒晶体学(SFX)实验。采用PORTO飞秒脉冲激光系统进行光笼激活，波长308 nm，通过中性密度滤光片调节激光功率。数据处理使用xia2.ssx管道和DIALS软件，结构解析采用分子置换和迭代精修方法。通过B因子分析和F_o-F_c差值密度量化评估NO占据率。

3.1. UV–Vis characterization

紫外-可见光谱表征结果显示，合成的NO cage在300 nm处有最大吸收峰，白光闪光后发生光谱变化，证实了光解和NO释放。DtpB和McCP-β与PROLI NONOate（NO供体）作用后，Soret峰分别从401 nm红移至419 nm（DtpB）和从400 nm红移至417 nm（McCP-β），Q带出现分裂特征，证实了六配位铁血红素-NO复合物的形成。

3.2. Resting state, ‘dark’ control and positive control PROLI NONOate structures

获得了DtpB和McCP-β的静息态结构，显示DtpB为五配位血红素，具有"干燥"的远端口袋；McCP-β的室温结构显示Phe32位移，为NO结合创造空间。使用PROLI NONOate获得了完全占据的NO结合结构，McCP-β中Fe-N键长约为1.90-1.91 ?，Fe-N-O键角134-153°。暗对照实验证实光笼化合物不会自发泄漏释放NO。

3.3. Laser initiated NO binding

通过激光功率滴定实验，发现NO占据率随激光功率增加而增加，然后趋于稳定。McCP-β在低至0.19 μJ的激光功率下仍能实现完全NO占据。DtpB的六聚体中各单体显示不同的NO占据率，可能与晶体溶剂通道的差异有关。研究还发现初期实验因芯片方向和密封膜不当导致需要较高激光功率，优化后大幅降低了所需功率。

3.4. Time-resolved SFX using the NO cage

使用粘性挤出器在SACLA获得了McCP-β的20 ms时间点结构，NO占据率为0.7。固定靶实验显示DtpB在100 μs时间点已有NO结合，占据率随激光功率增加（30 μJ时为0.30，100 μJ时为0.45）。10 ms时间点占据率略高于100 μs，但仍呈功率依赖性。所有结构均显示NO以末端结合方式与铁配位，Fe-N距离约2.0-2.5 ?，Fe-N-O角度约105-150°。

本研究成功建立了基于固定靶样品传输系统的NO光笼时间分辨晶体学方法，能够在室温下研究血红素蛋白的NO结合过程，时间范围覆盖微秒到秒级。研究发现激光功率与NO占据率呈正相关，但即使低功率(0.19 μJ)也能有效释放光笼。DtpB六聚体中各单体的NO占据率差异揭示了晶体晶格和溶剂通道对配体扩散的重要影响。该方法为研究非光激活酶的反应动力学提供了强大工具，特别适用于气体信号分子与血红素蛋白的相互作用研究。对McCP-β和DtpB的NO结合结构的解析不仅为理解这些蛋白的生物学功能提供了新线索，也为未来捕捉瞬态反应中间体奠定了基础。光笼技术与固定靶方法的结合将使科学家能够获得酶反应或信号过程的"定格动画"电影，极大地推动了对蛋白质动态过程的理解。