STK4通过磷酸化HOIP变构泛素结合位点抑制其E3活性的机制研究

本研究针对STK4激酶如何特异性调控线性泛素链组装复合物（LUBAC）核心催化亚基HOIP的E3泛素连接酶活性这一关键科学问题，通过生物化学、质谱和结构生物学方法系统阐明了STK4激酶结构域与HOIP RING2-LDD模块的直接结合机制，首次发现STK4通过磷酸化HOIP T786位点（位于变构泛素结合位点）而非先前报道的S1066位点来抑制其E3活性，为RBR型E3连接酶的调控机制提供了全新范式，对理解NF-κB信号通路的精细调控具有重要意义。

　　

在细胞信号传导的世界里，泛素化修饰犹如一位精巧的指挥家，通过调节蛋白质的稳定性、活性和定位，掌控着生命活动的方方面面。其中，线性泛素链组装复合物（LUBAC）作为唯一已知能够催化M1型（线性）泛素链形成的E3连接酶复合物，在NF-κB信号通路、炎症反应、细胞凋亡和自噬等关键生物学过程中扮演着核心角色。LUBAC由三个亚基组成：催化亚基HOIP（一种RBR型E3连接酶）和两个调节亚基HOIL-1L与Sharpin。HOIP的活性受到精密调控，其功能障碍与多种免疫缺陷和炎症性疾病密切相关。

然而，科学家们对LUBAC活性的具体调控机制，特别是激酶介导的磷酸化修饰如何影响其功能，仍知之甚少。近年来研究发现，丝氨酸/苏氨酸激酶STK4（又称MST1）能够直接磷酸化HOIP并抑制其E3活性，从而减弱NF-κB信号通路的激活。但STK4如何特异性识别HOIP，以及通过磷酸化哪个具体位点来实施这种抑制，这些关键机制问题一直悬而未解，阻碍了人们对这一重要调控通路的深入理解。

为了揭开这一谜团，研究人员开展了一项系统性的研究，综合运用了多种先进的技术方法。他们首先通过分子克隆技术构建了STK4和HOIP的各种截短体及点突变体，为后续研究准备了关键实验材料。利用尺寸排阻色谱（SEC）和等温滴定量热法（ITC）等技术，研究人员精确测定了STK4与HOIP之间的相互作用强度和结合区域。通过X射线晶体学方法，他们成功解析了STK4激酶结构域与HOIP RING2-LDD复合物的高分辨率晶体结构，这是该研究的突破性进展之一。体外磷酸化实验结合Phos-tag凝胶电泳技术帮助验证了磷酸化事件，而高分辨率质谱分析则精确鉴定了HOIP上的磷酸化位点。分析型超速离心技术被用于研究蛋白质的寡聚化状态，小角X射线散射（SAXS）则分析了蛋白质的整体构象。最后，体外泛素化实验和E2~Ub解离实验直接评估了HOIP的E3连接酶活性。

STK4能够通过其激酶结构域特异性结合HOIP的RING2-LDD区域

研究人员首先通过系统的生物化学分析发现，激酶失活的STK4 K59R突变体不能与HOIL-1L或Sharpin相互作用，但能够直接结合HOIP（480-1072）片段和包含RING1-IBR-RING2-LDD模块的HOIP（697-1072）片段。通过截短分析和ITC测定，他们将相互作用区域精确缩小到STK4的激酶结构域（KD）和HOIP的RING2-LDD区域之间，测得的解离常数（Kd）约为102 μM。分析超速离心结果显示STK4 KD存在浓度依赖的单体-二聚体平衡，而HOIP RING2-LDD在溶液中是稳定的单体，两者能够形成不稳定的二元复合物。

HOIP RING2-LDD与STK4 KD复合物的整体结构

研究人员成功解析了HOIP RING2-LDD/STK4 KD复合物的晶体结构，分辨率达到2.8埃。结构显示每个不对称单元包含一个STK4 KD二聚体和两个HOIP RING2-LDD分子，形成对称的蝴蝶状异源四聚体。STK4 KD采用典型的激酶折叠结构，而HOIP RING2-LDD通过其RING2区域和LDD结构域中的β5和β6链特异性结合到STK4 KD的C叶。结构比较发现HOIP RING2-LDD在与STK4结合后构象变化很小。

HOIP RING2-LDD与STK4 KD之间的相互作用界面

详细的结构分析揭示了STK4 KD主要通过其C叶的αG螺旋、催化环和激活环与HOIP RING2-LDD相互作用。界面面积约为800埃2，涉及广泛的疏水作用、氢键和盐桥。关键相互作用包括STK4的R231与HOIP的E1005和D1008形成的盐桥，以及STK4的N239与HOIP的D1008形成的氢键。突变这些界面残基（如STK4 R231E和N239A）显著减弱了STK4与HOIP在细胞中的相互作用。

HOIP S1066的磷酸化不影响HOIP的E3活性

与先前报道不同，研究人员发现HOIP S1066E磷酸模拟突变体在体外线性泛素化实验中表现出与野生型HOIP相似的催化线性泛素链形成的能力。STK4能够同等抑制野生型和S1066A突变型HOIP的E3活性。SEC分析进一步证实S1066E突变体仍能良好结合线性二泛素（M1-2Ub）或四泛素（M1-4Ub），表明S1066磷酸化不太可能影响HOIP的E3活性。

HOIP T786的磷酸化是STK4抑制HOIP E3活性的主要原因

研究人员通过体外磷酸化实验和质谱分析，在HOIP（697-1072）片段上鉴定出12个STK4介导的磷酸化位点，包括T786。结构分析显示T786位于HOIP RING1的变构泛素结合位点，直接参与与泛素的相互作用。体外泛素化实验表明，STK4主要通过其激酶活性而非单纯结合来抑制HOIP的E3活性。T786A突变体抵抗STK4介导的磷酸化和E3活性抑制，而T786E磷酸模拟突变体在体外和细胞内均显示E3活性降低，激活NF-κB信号的能力也减弱。

STK4介导的HOIP T786磷酸化通过破坏变构泛素结合来抑制HOIP的E3活性

SAXS和结构建模分析表明T786E突变不会显著改变HOIP RBR-LDD的结构折叠。SEC分析显示T786E突变减少了HOIP（697-852）与M1-8Ub（已知结合HOIP变构泛素结合位点）的相互作用。ITC分析表明T786E突变基本上废除了HOIP（697-1072）与UBE2L3~Ub在M1-2Ub存在下的相互作用。E2~Ub解离实验证明T786E突变有效降低了泛素从E2~Ub结合物到HOIP催化半胱氨酸的转移。体外磷酸化结合E2~Ub解离实验进一步证实STK4介导的HOIP磷酸化抑制了泛素从E2~Ub结合物到E3 HOIP的转移。

研究结论和讨论部分指出，这项工作揭示了STK4通过特异性识别HOIP RING2-LDD模块并磷酸化其T786位点（位于变构泛素结合位点）来抑制HOIP E3活性的精细分子机制。这一发现不仅纠正了先前关于S1066磷酸化起主要作用的观点，更重要的是首次揭示了RBR型E3连接酶的变构泛素结合位点可以通过翻译后修饰（如磷酸化）进行调控的新范式。

该研究解析的STK4 KD与HOIP RING2-LDD复合物结构是首个展示STK4激酶如何识别其底物的原子结构，为理解激酶-底物特异性识别提供了重要见解。结构分析表明STK4 KD以独特的方式二聚化，但这种二聚化对其磷酸化HOIP的能力并非必需。

研究发现STK4介导的HOIP T786磷酸化直接干扰了变构泛素与HOIP的结合，从而降低了泛素从E2~Ub结合物到HOIP的转移效率，最终抑制了其E3活性。这一机制解释了为何STK4需要其激酶活性而不仅仅是结合来抑制HOIP。

基于这些发现，研究人员提出了一个模型：孤立状态的HOIP可能处于部分自抑制状态，当泛素分子结合到其变构位点时，会诱导构象变化解除自抑制，促进E2-Ub结合和后续的转硫醇反应。而活化的STK4通过其KD与HOIP RING2-LDD特异性结合后，磷酸化T786残基，阻断泛素与HOIP变构位点的结合，最终导致HOIP E3活性的抑制。

这项研究发表于《Cell Discovery》，为理解RBR型E3连接酶的调控机制提供了全新视角，对开发针对NF-κB信号通路相关疾病（如自身免疫疾病和炎症性疾病）的新型治疗策略具有重要指导意义。