抑制HDAC7重塑组蛋白H3.3景观以诱导癌细胞异染色质扩散与DNA复制缺陷

本研究针对HDAC7在胶质母细胞瘤中的高表达及其与患者不良预后的关联，通过特异性siRNA抑制HDAC7，发现其可重构H3.3表观遗传景观，促进H3K9me3+异染色质扩散，增加复制压力并增强癌细胞对DNA损伤剂的敏感性，为靶向HDAC7的癌症治疗提供了新策略。

　　

在癌症研究中，表观遗传调控机制日益成为关注焦点。染色质状态的动态变化，特别是常染色质与异染色质之间的转换，深刻影响基因表达和细胞命运，在肿瘤发生和发展中扮演关键角色。组蛋白去乙酰化酶（HDACs）作为重要的表观遗传调控因子，其家族成员功能多样，其中IIa类HDACs因酶活性微弱，其具体作用机制和功能长期以来存在争议。HDAC7作为IIa类成员，在多种癌症中表达升高，与肿瘤不良预后相关，但其在染色质动力学和DNA复制中的具体作用尚未明确。同时，组蛋白变体H3.3以复制非依赖方式掺入染色质，其在常染色质和异染色质沉积之间的平衡由分子伴侣复合物（如HIRA和DAXX/ATRX）精密调控，这一平衡的破坏可能与肿瘤细胞可塑性和治疗抵抗密切相关。然而，HDAC7是否以及如何参与调控H3.3的染色质景观，进而影响癌症细胞的表观遗传状态和基因组稳定性，仍是一个未解之谜。这项发表在《Journal of Biological Chemistry》的研究，深入探索了HDAC7在胶质母细胞瘤（Glioblastoma）和弥漫性内生性桥脑胶质瘤（DIPG）细胞中的功能，揭示了其通过调控H3.3沉积诱导异染色质扩散和复制缺陷的新机制。

研究人员综合运用了患者肿瘤组织（84例胶质母细胞瘤FFPE样本）及患者来源的肿瘤干细胞（GSCs, n=6；DIPG细胞, n=3）模型、特异性siRNA基因敲降、蛋白质组学（RIME交互组分析）、组蛋白修饰质谱（ModSpec）、免疫共沉淀（Co-IP）、邻近连接技术（PLA）、染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、单分子DNA纤维分析、RNA测序（RNA-seq）以及细胞功能实验（如肿瘤球形成、DNA损伤药物敏感性）等多种关键技术方法。

HDAC7 is highly expressed in glioblastoma tumors and correlates with decreased patient survival

通过对癌症基因组图谱（TCGA）数据的分析，发现HDAC7是IIa类HDAC中唯一在胶质母细胞瘤中显著高表达的成员，其高表达与患者生存期缩短显著相关。对84例患者样本的NanoString分析进一步证实，HDAC7高表达与45个促癌基因（如Vimentin, LOX）的上调相关。

Expression of HDAC7 in adult glioblastoma and pediatric DIPG cells

蛋白质印迹和免疫荧光实验证实，HDAC7在患者来源的GSCs和DIPG细胞核内高表达，而在正常人星形胶质细胞中表达很低。

Class specificity of HDAC7 siRNA

研究人员设计并筛选出了一种特异性靶向HDAC7的siRNA（siRNA-2），该siRNA能有效敲低HDAC7蛋白表达，而不影响其他IIa类HDACs（HDAC4, HDAC5, HDAC9）的表达。

MS profiling of histone marks following inhibition of HDAC7 expression

组蛋白修饰质谱分析显示，抑制HDAC7并不影响组蛋白乙酰化水平，但显著增加了与异染色质相关的修饰，如H3K9me1、H3.3K27me1和H3.1K27me1，同时减少了未修饰的H3K9，表明染色质景观向异染色质重塑。

Rapid Immunoprecipitation Mass Spectrometry of Endogenous Proteins (RIME) to identify the HDAC7 interactome within the nucleus

RIME技术揭示了HDAC7在细胞核内与247个蛋白质存在相互作用，其一级互作组（包括NCOR2、H3.3、CTNNB1(β-catenin)、CHD4等）形成了一个高度互连的网络，功能富集于转录调控、Notch和Wnt信号通路。

HDAC7 interacts with Histone H3.3 and the H3.3 mutant variant H3K27M

免疫共沉淀和PLA实验直接证实了HDAC7与组蛋白H3.3以及癌组蛋白突变体H3.3K27M在细胞核内存在特异性相互作用。

Inhibition of HDAC7 reduces interaction of H3.3 with HIRA and increases interaction with DAXX and H3K9me3

抑制HDAC7后，H3.3与常染色质伴侣HIRA的结合减少，而与异染色质伴侣DAXX以及异染色质标记H3K9me3的结合显著增加。H3.3 Cut&Tag实验表明，HDAC7抑制并未全局改变H3.3的基因组定位，而是促进了其向异染色质的重新平衡。

HDAC7 inhibition results in increased levels of SETDB1, and H3K9me3

蛋白质印迹和ELISA实验证实，抑制HDAC7后，催化H3K9三甲基化的甲基转移酶SETDB1的表达上调，全局H3K9me3水平显著增加。

Inhibition of HDAC7 induces heterochromatin spreading in cancer cells

免疫荧光和透射电镜（TEM）观察直观地显示，抑制HDAC7后，H3.3更多地定位于DAPI⁺的异染色质焦点，核内H3K9me3⁺焦点数量显著增加，电子致密的异染色质发生扩散。

Inhibition of HDAC7 results in increased H3K9me3 distribution in the cancer genome

H3K9me3 ChIP-seq分析揭示，HDAC7抑制后，H3K9me3在基因组上的分布发生重编程，虽然结合位点总数减少，但在306个特定区域（邻近214个基因）的信号强度显著增加且峰更尖锐，这些基因功能涉及细胞周期、DNA复制和胶质瘤生物学。

Inhibition of HDAC7 results in broad transcriptomic changes in cancer cells

RNA-seq分析显示，抑制HDAC7导致194个基因显著下调，功能富集于细胞周期进程、G1-S期转换、DNA复制和端粒维持。基因集富集分析（GSEA）表明，DNA复制（MCM2-7, ORC1）和G1-S转换（MYC, E2F1, CDC6）的核心调控因子表达显著降低。癌症干细胞相关信号（Notch, Myc）也被抑制，体外肿瘤球形成实验证实HDAC7抑制显著削弱了GSCs的自我更新能力。

Inhibition of HDAC7 alters cell cycle and DNA replication dynamics

EdU掺入实验表明HDAC7抑制显著降低了DNA合成。流式细胞术显示细胞周期分布发生变化，G1期细胞减少，G2期细胞积累。单分子DNA纤维分析揭示了一个关键现象：HDAC7抑制后，DNA复制叉速度显著增加（中位数从0.79 kb/min增至1.4 kb/min，提升57%），但复制叉对称性未受影响。同时，MCM2-7复合物（复制起始许可关键因子）和BRCA2（同源重组修复和复制叉保护蛋白）的表达下调。免疫荧光显示H3K9me3与EdU⁺复制焦点共定位，表明异染色质环境下的DNA复制仍在进行。

HDAC7 inhibition results in replication stress and sensitization of cancer cells to DNA damaging agents

复制叉速度的异常增加和复制起源许可的减少共同导致了复制压力，表现为RPA32-S4/8磷酸化增加（复制压力标志）。虽然基础γH2AX（DNA双链断裂标志）水平未显著变化，但BRCA2的下调提示同源重组修复能力受损。这种脆弱的复制环境使癌细胞对DNA损伤剂（如替莫唑胺TMZ和依托泊苷Etoposide）更加敏感。联合使用siHDAC7和TMZ或Etoposide可协同诱导更高水平的γH2AX并显著抑制癌细胞生长。

研究结论与讨论部分强调，本研究将HDAC7的功能从传统的（尽管很弱的）去乙酰化酶范畴中解放出来，重新定义为其在癌细胞中是一个关键的H3.3相关染色质景观调控因子。HDAC7通过与H3.3和HIRA复合物相互作用，倾向于维持常染色质环境。抑制HDAC7会打破H3.3沉积的平衡，使其转向与DAXX和H3K9me3结合的异染色质状态，最终引发大规模的异染色质扩散和表观遗传限制。这种染色质重编程直接导致了深刻的转录组变化，关键细胞周期和DNA复制基因被抑制。更重要的是，研究揭示了HDAC7抑制通过诱导复制叉加速、减少复制起源许可和削弱复制叉保护机制，从而在癌细胞中创造了一个独特的“复制压力-修复缺陷”脆弱状态，使其对现有化疗药物（如TMZ）高度敏感。这些发现不仅阐明了HDAC7在癌症表观遗传调控中的新颖机制，更重要的是为联合使用HDAC7抑制剂与DNA损伤剂治疗胶质母细胞瘤等恶性癌症提供了强有力的理论依据和令人兴奋的治疗策略。