高脂高糖饮食下雄性小鼠肝脏半胱氨酸氧化还原组图谱揭示代谢应激的分子开关机制

本刊推荐：为解析高脂高糖饮食（HFHSD）诱导的肝脏代谢紊乱中半胱氨酸氧化还原修饰的动态调控机制，研究人员采用差异化烷基化标记策略，系统性绘制了小鼠肝脏半胱氨酸氧化还原组图谱。研究发现HFHSD并未引起全局性氧化还原失衡，但特异性调控了169个半胱氨酸残基的氧化还原状态，这些位点集中于线粒体与胞浆（氧化敏感）及胞外区域（还原敏感），并富集于谷胱甘肽代谢、PPAR信号通路等35条代谢通路。该研究揭示了静电微环境与亚细胞定位共同决定半胱氨酸氧化还原敏感性的新规律，为糖尿病及其并发症的靶向治疗提供了新视角。

　　

随着全球饮食结构的改变，高脂高糖饮食（HFHSD）已成为诱发肥胖、2型糖尿病及代谢相关脂肪性肝病（MASLD）的重要环境因素。这类饮食模式通过扰乱葡萄糖和脂质代谢，导致活性氧（ROS）过度生成，引发氧化应激，进而破坏内质网和线粒体稳态，最终导致胰岛素分泌障碍和肝脏胰岛素抵抗。然而，氧化应激并非故事的全部。生理水平的ROS同样是精细调控信号转导和细胞稳态所必需的。特别值得注意的是，近年来研究发现，一种主要由肝脏分泌的蛋白质——硒蛋白P（Selenoprotein P），作为与糖尿病相关的肝因子，会通过清除生理性ROS导致“还原应激”（reductive stress），同样能引起肝脏胰岛素抵抗、血管内皮生长因子抵抗及骨骼肌运动抵抗。因此，全面理解糖尿病病理的分子机制，必须同时关注氧化应激和还原应激的靶点。

在这一背景下，蛋白质中的半胱氨酸（Cysteine, Cys）残基因其巯基（-SH）可逆的氧化还原修饰（Cys-PTMs），如二硫键（S-S）、亚磺酰化（S-sulfenylation, S-OH）、硝基化（S-nitrosylation, S-NO）和谷胱甘化（S-glutathionylation, S-SG），而扮演着蛋白质结构和功能动态调节的“分子开关”角色。其反应活性深受邻近带电氨基酸构成的静电微环境的影响。尽管此前已有研究探索了小鼠肝脏在衰老、高脂饮食/禁食及乙醇消耗等状态下可逆氧化的半胱氨酸的作用，但还原性半胱氨酸在病理过程中的作用仍未得到充分研究。HFHSD既能升高细胞内ROS水平，促进氧化修饰，又能上调肝脏硒蛋白P的表达，使细胞 redox 平衡向还原状态偏移，这使其成为同时观察蛋白质氧化和还原变化的理想模型。

为了更深入地理解肝脏代谢稳态，需要对包括可逆氧化和还原的半胱氨酸残基在内的体内半胱氨酸氧化还原组进行完整的分析。由Cynthia M. Galicia-Medina、Hein Ko Oo和Toshinari Takamura等人组成的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们应用了一种便捷的策略来评估半胱氨酸氧化还原景观，利用能够同时检测可逆氧化和还原半胱氨酸残基的优势，分析了喂食正常饲料（NCD）或HFHSD的雄性小鼠肝脏。

研究人员为开展本研究，主要应用了以下几项关键技术方法：研究使用C57BL/6J野生型雄性小鼠，分别喂食NCD或HFHSD长达16周，最终采集4只小鼠为一组的肝脏样本进行后续分析。核心技术为基于差异化烷基化的蛋白质组学技术，该技术无需变性剂，通过N-乙基马来酰亚胺（NEM）标记还原态半胱氨酸，三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原后，再用生物素-peac5-马来酰亚胺（BPM）标记氧化态半胱氨酸。标记后的蛋白质经胰蛋白酶消化，所得肽段通过高pH反相肽段分级进行脱盐，最后利用液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术进行鉴定和定量分析。生信分析包括GO和KEGG通路富集分析、蛋白互作网络构建（GeneMANIA）、序列 motif 分析，以及基于蛋白质结构（来自AlphaFold和PDB数据库）的pKa、二面角应变能（DSE）和静电表面电位计算等。

研究结果

Profiling the liver cysteine redoxome and proteome of mice fed an NCD or HFHSD

研究人员首先通过非变性条件下的差异化烷基化蛋白质组学技术，绘制了喂食NCD或HFHSD的雄性小鼠肝脏的半胱氨酸氧化还原组图谱。他们成功鉴定出超过5000个氧化和还原的半胱氨酸残基。结果显示，两组小鼠肝脏中氧化和还原半胱氨酸的全局及亚细胞分布比例保持稳定，表明HFHSD并未诱导广泛的半胱氨酸氧化还原平衡偏移。蛋白质组学分析揭示，HFHSD上调了与基因组稳定性、脂质解毒和能量调节相关的蛋白质，而下调了与解毒和代谢灵活性相关的蛋白质。

Classification of HFHSD-sensitive cysteine residues and their functional roles in liver metabolic pathways and redox regulation

通过严格筛选（至少在2个独立重复中一致检测到），研究鉴定出169个对HFHSD敏感的动态半胱氨酸残基（HFHSD dynamic cysteines），约占一致鉴定半胱氨酸的4%。这些动态残基可进一步分为HFHSD诱导的氧化、HFHSD诱导的还原、组成型氧化和组成型还原等类别。KEGG富集分析显示，这些动态半胱氨酸映射到35条代谢通路，包括谷胱甘肽代谢、PPAR信号通路、脂肪酸降解、TCA循环和糖异生等，它们处于氧化还原平衡和能量稳态的核心。互作网络分析揭示了关键代谢调节因子（如GSTM1、GCLM、ADH1、ACAA2）之间存在强大的功能关联。细胞组分（CC）分析表明，对HFHSD诱导还原敏感的半胱氨酸在胞外区域和细胞质中富集，而对HFHSD诱导氧化敏感的半胱氨酸则在细胞质和线粒体中富集。

Distinct motifs for HFHSD-sensitive cysteine residues

序列 motif 分析发现，HFHSD动态半胱氨酸残基以及对HFHSD诱导氧化敏感的残基，在其-1位点显著富集带正电的赖氨酸（Lys, K），并在+2位点富集谷氨酸（Glu, E），形成KCxE motif。分子结构模拟分析（以GLUL和PFN1蛋白为例）表明，该motif中的带电氨基酸通过形成盐桥参与稳定蛋白质结构，而半胱氨酸的氧化修饰（如亚磺酰化，Cys-SOH）会引发空间位阻（van der Waals clashes）并改变其静电表面电位，提示这可能影响蛋白质的相互作用和活性。相比之下，对HFHSD诱导还原敏感的半胱氨酸则缺乏显著的带电氨基酸motif，但显示出非极性/极性氨基酸的独特模式。

Physicochemical properties of reactive cysteine residues in HFHSD

对半胱氨酸残基的理化性质深入分析发现，对HFHSD诱导还原敏感的半胱氨酸有60%参与分子内二硫键的形成，且主要暴露于蛋白质表面（0%被埋藏）。与之相反，对HFHSD诱导氧化敏感的半胱氨酸绝大多数（82.1%）不参与二硫键形成。所有类别半胱氨酸的预估pKa值和二硫键二面角应变能（DSE）均无显著差异，表明其氧化还原敏感性并非由内在热力学性质决定，而是由微环境因素（如带电氨基酸的邻近性）主导。

讨论与结论

本研究应用了一种直接策略，首次在喂食NCD和HFHSD的雄性小鼠肝脏中绘制了涵盖超过5000个氧化和还原半胱氨酸残基的氧化还原组景观。一个重要发现是，HFHSD并未影响半胱氨酸残基的全局和亚细胞氧化还原平衡的转变。

功能分析表明，HFHSD上调的蛋白质富集于维持基因组稳定性、表观遗传调控、脂质解毒和能量调节等生物过程，而下调的蛋白质则与解毒功能受损、脂质氧化抑制和代谢灵活性破坏相关。这些通路的集体失调共同促进了肝脏代谢疾病的发展和进展。

研究核心在于鉴定出的169个HFHSD动态半胱氨酸残基，它们构成了一个响应饮食应激的协调的 redox 传感网络，并富集于连接氧化还原平衡与能量稳态的核心代谢通路。这些敏感残基的亚细胞定位和结构动力学揭示了它们在氧化还原适应中的特殊作用：氧化敏感残基主要位于线粒体和细胞质，参与能量产生和氧化还原平衡；而还原敏感残基富集于胞外区域，多数参与二硫键形成并暴露于表面，提示它们可能作为蛋白质构象变化或功能的“开关”。

Motif和结构分析证明，半胱氨酸的氧化还原敏感性由独特的静电微环境（如KCxE motif）决定，这为理解氧化应激如何特异性靶向蛋白质提供了分子基础。此外，本研究不仅验证了先前高脂饮食（HFD）研究中报道的13个氧化敏感半胱氨酸位点（如FABP1的Cys⁶⁹），还新发现了90个对HFHSD诱导还原敏感的半胱氨酸位点，这凸显了在氧化还原组景观中同时绘制氧化和还原半胱氨酸对于发现肝脏代谢应激新靶点的重要性。

总之，该研究揭示了亚细胞定位、蛋白质结构定位和静电微环境共同决定了半胱氨酸残基的反应性，为了解肝脏代谢疾病中区室化的氧化还原调控提供了见解。当前的氧化还原组策略拓宽了肝脏半胱氨酸蛋白质组的景观，提供了一种识别肝脏疾病潜在治疗性半胱氨酸靶点的技术。理解半胱氨酸还原（而不仅仅是氧化）可能有助于开发调节半胱氨酸氧化还原状态的有效疗法，从而为针对糖尿病及其并发症的药物开发做出贡献。