丝氨酸蛋白酶HTRA1靶向Tau纤维并建立对抗致病性蛋白质构象的蛋白水解屏障

本研究揭示了丝氨酸蛋白酶HTRA1被Tau纤维激活并有效降解其结构的分子机制。通过高分辨率质谱分析和活细胞成像技术，研究人员证明HTRA1通过独特的"先解离后降解"机制清除Tau聚集体，显著抑制病理性蛋白的细胞间传播，为神经退行性疾病提供了新的治疗靶点。

　　

在神经退行性疾病的研究领域，蛋白质错误折叠和聚集一直是科学家们关注的焦点。阿尔茨海默病(AD)、额颞叶痴呆伴帕金森综合征(FTDP)等tau蛋白病被归类为蛋白质折叠疾病，因为它们都以淀粉样纤维的存在为共同特征。这些由tau蛋白形成的淀粉样纤维随着时间推移在组织中不断积累和扩散，而衰老组织中蛋白质质量控制系统的功能减退被认为会加速这一过程。

然而，科学家们对于特定的蛋白质质量控制因子如何干预纤维积累从而延缓疾病发生仍缺乏深入理解。在这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，研究团队将目光投向了广泛保守的丝氨酸蛋白酶HTRA1(High Temperature Requirement A1)，探索了它在对抗tau蛋白病理中的潜在作用。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法：使用重组蛋白表达和纯化技术获得HTRA1和tau蛋白；通过交叉链接质谱分析(Cross-linking mass spectrometry)确定了HTRA1与tau纤维的结合位点；采用时间分辨质谱技术(Time-resolved mass spectrometry)详细解析了蛋白水解过程；利用活细胞荧光显微镜(Live cell fluorescence microscopy)观察HTRA1与tau纤维在细胞内的相互作用；通过体外种子聚集实验(In vitro seeding aggregation assay)评估HTRA1对tau种子形成的抑制作用；使用透射电子显微镜(Transmission electron microscopy)和沉降分析(Sedimentation assay)定量分析纤维形态和数量。

激活HTRA1的tau纤维和结合位点鉴定

研究人员发现tau纤维能够显著激活HTRA1蛋白酶活性，使其活性提高2.5倍以上，而可溶性tau则没有这种激活效果。通过交叉链接质谱分析，团队鉴定出HTRA1中三个与tau纤维种子广泛交联的残基：位于传感器环L3中的K305、位于蛋白酶和PDZ结构域边界的K375，以及位于活性位点对面环中的K261。这些发现表明tau纤维比可溶性tau更紧密地与HTRA1活性位点结合，这种激活作用支持了纤维的高效降解。

HTRA1依赖性tau蛋白水解处理的高分辨率分析

通过时间分辨质谱分析，研究人员对可溶性和纤维状tau的蛋白水解动态进行了详细解析。研究发现tau的N端半部(残基1-225)表现出蛋白酶抗性，而C端区域则被高效切割。对可溶性tau的分析识别出了36个切割位点(15秒后)和111个位点(120分钟后)，其中7个P1残基(V256、C291、I308、C322、L376、I392、L408)的切割频率最高。

HTRA1对纤维状tau的蛋白水解

对于tau纤维，时间分辨质谱显示15秒后检测到31个切割位点，120分钟后检测到117个位点。HTRA1对tau纤维的蛋白水解起始于β-片层核心周围区域，随后在核心区域内进行多次切割。纤维核心最初被加工成4个片段，然后这些片段依次降解为最小尺寸在7到17个残基之间的小肽。

N端和C端互换的tau衍生物的蛋白水解

为了探究tau的N端区域意外蛋白酶抗性和C端区域显著蛋白酶敏感性的原因，研究人员构建了tau CN构建体，将C端残基391-441与N端残基42-98互换。研究发现tau CN纤维的切割模式与野生型tau纤维相比仅发生轻微变化或没有变化，表明tau的N端部分是由于其氨基酸序列而不是其在多肽内的位置而成为较差的底物。

HTRA1减少体外tau种子形成

研究发现HTRA1能够干扰tau种子聚集。在体外重建实验中，添加tau种子使沉淀的tau量增加1.8倍，而HTRA1^S328A引起tau从沉淀物向上清液的浓度依赖性转移。在最高浓度的HTRA1^S328A下，88%的tau蛋白存在于上清液中，总纤维长度减少到对照的50%以下。活性HTRA1的蛋白水解产物在超速离心后不会沉淀，表明HTRA1介导的tau降解不会增加其聚集倾向。

HTRA1与细胞中tau种子共定位

活细胞旋转盘共聚焦显微镜显示，HTRA1^S328A-mCherry和DyLight 488标记的tau种子在两种处理条件下都观察到快速共定位。基于超过10,500个HTRA1和tau斑点的分析，研究人员检测到高达60%的共定位率，表明HTRA1与tau聚集体之间存在动态相互作用。

HTRA1减少细胞中种子tau聚集体的形成

使用纯化的重组蛋白水解活性HTRA1进行的实验显示，活性DyLight 633-HTRA1的摄取后，DyLight 488(tau)强度显著降低，表明HTRA1降低了细胞中tau聚集体的水平，这与其蛋白水解活性一致。

研究结论和讨论部分强调了HTRA1作为ATP非依赖性酶的独特优势，使其能够在细胞内和细胞外发挥作用，提供了优于先前鉴定的涉及淀粉样纤维解离或降解的因子的优势。与需要ATP的热休克伴侣和AAA⁺ ATP酶VCP不同，HTRA1能够将纤维解离和降解功能结合在一起，确保提取的多肽不会保留种子能力。

时间分辨质谱分析表明，HTRA1对tau纤维的蛋白水解降解起始于β-片层核心周围区域，随后在核心区域内进行多次切割。这一发现表明HTRA1靶向易于聚集的构象，这可以通过蛋白水解的诱导拟合机制来解释。该模型得到了tau纤维比非结构化可溶性tau更能激活蛋白水解活性的支持。

研究人员还展示了HTRA1在沉降实验和TEM分析中干扰种子tau纤维形成。尽管在这些体外重建实验中使用的HTRA1浓度高于组织中预期的浓度，但这种条件在纯化生化系统中是标准的，用于证明对抵抗性底物的催化能力。重要的是，相关的比较不是蛋白酶与tau单体的整体化学计量，而是三聚体HTRA1与tau纤维呈现的密集切割位点阵列的相互作用。

除了HTRA1，许多其他蛋白酶已被证明切割tau蛋白，但大多数已识别的17种蛋白酶的切割位点位于β-片层形成区域之外。因此，许多由各种蛋白酶产生的tau片段已被证明介导寡聚体形成、聚集和细胞毒性，或在患者脑样本中被识别，因此被怀疑与tau蛋白病有关。

研究表明，HTRA1可以从培养基中被摄取进入自身不产生HTRA1的细胞中以执行蛋白质质量控制。因此，分泌的HTRA1有可能扩散通过组织。其进入蛋白质稳态受损的受体细胞将降低tau纤维水平，从而降低致病性tau构象传播的能力。有趣的是，健康非神经元细胞产生的HTRA1(不含有tau纤维)使得神经元细胞中的非自主蛋白质稳态成为可能。

这些数据突出了HTRA1的治疗潜力，因为它位于细胞外和细胞内，并在tau和Aβ纤维沉积位点积累。研究人员进一步提出了在健康细胞中提高HTRA1生产的潜力，以保护被蛋白质聚集体损害的细胞。与此一致的是，在AD患者样本和tau转基因小鼠模型中HTRA1水平升高。

总之，这项由Birte Hagemeier、Kamilla Ripkens、Nina Schulze等研究人员完成的研究，深入揭示了HTRA1在对抗tau蛋白病理中的关键作用，为开发神经退行性疾病的新治疗策略提供了重要的分子基础。