小肠氨基酸转运体LAT2/4F2hc介导植物源烟胺铁复合物的基底外侧外排机制研究

本研究揭示了植物源铁螯合剂烟胺（NA）与铁形成的复合物（NA-Fe(II)）在小肠中的新型吸收机制。研究人员发现，异二聚体氨基酸转运体LAT2/4F2hc负责介导NA-Fe(II)复合物从肠道上皮细胞基底侧外排进入血液循环，这一发现为理解膳食铁吸收提供了新视角，对改善铁缺乏性贫血具有重要意义。

　　

铁是几乎所有生物体必需的微量元素，在氧气运输、DNA合成和电子传递链等关键代谢过程中发挥着不可替代的作用。然而，全球约三分之一人口受到铁缺乏性贫血的困扰，其中40%的6-59月龄儿童和37%的孕妇存在铁缺乏问题，使其成为重要的全球公共卫生问题。

膳食铁主要以植物源和动物源两种形式存在。在动物性食物中，铁主要以血红素形式存在，生物利用度较高；而在植物性食物中，铁主要以非血红素形式存在，生物利用度较低。在胃部酸性环境中，铁被稳定为还原态的Fe(II)(亚铁离子)，但大多数膳食铁最初以氧化的Fe(III)(铁离子)形式存在，其水溶性较低，生物利用率也较差。

传统的铁吸收机制主要发生在十二指肠部位。Fe(III)通过十二指肠细胞色素b(Dcytb)还原为Fe(II)，然后通过位于十二指肠上皮细胞顶膜的二价金属转运蛋白1(DMT1，也称为SLC11A2)吸收。进入细胞后，铁要么与铁蛋白结合储存，要么通过基底侧铁转运蛋白ferroportin 1(FPN1，也称为SLC40A1)输出到血液中。

然而，Gunshin等人的研究表明，膳食Fe(II)的吸收还存在不依赖于Dcytb/DMT1活性的额外机制。这一发现提示我们，铁的吸收可能存在着更为复杂和多样化的途径。

植物是动物获取铁的主要来源。无论是草食动物直接从植物中吸收铁，还是肉食动物通过食用草食动物间接获取铁，都离不开植物对铁的吸收和利用。在植物中，烟胺(nicotianamine, NA)作为一种普遍存在于高等植物中的六齿金属螯合剂，在铁转运过程中发挥着关键作用。

NA是 mugineic acid-based植物铁载体(MAs)的前体，也是植物中铁螯合剂的主要来源。虽然NA优先螯合Fe(II)，但在高pH条件下也能与Fe(III)结合。这种双重结合能力使NA能够作为细胞内铁清除剂，保护细胞免受铁诱导的氧化损伤。NA-Fe(II)或MAs-Fe(III)复合物通过YS1/YSL转运蛋白跨膜运输，这些蛋白属于寡肽转运蛋白家族，也参与寡肽和氨基酸衍生物的运输。

可食用植物如豆类、蔬菜和果汁中含有丰富的NA。研究表明，NA能够增强Caco-2单层细胞(肠道吸收模型)中的铁摄取，植物源性食物中铁的生物利用度随着NA含量的增加而提高，表明NA在有效利用铁方面具有潜在作用。

先前的研究发现，质子偶联氨基酸转运蛋白PAT1(SLC36A1)促进了NA和NA-Fe复合物在小肠近端空肠表面的转运。然而，NA-Fe(II)复合物在肠道摄取后的命运仍不清楚：究竟是直接被基底外侧外排转运蛋白输出到血液中，还是在肠道细胞内NA和铁被分离？后者情况下，NA可能被运输到溶酶体，而铁通过FPN1转运蛋白输出到血液中。

为了阐明NA介导的肠道铁摄取和外排机制，研究人员在《Journal of Biological Chemistry》上发表了这项研究，旨在鉴定近端空肠基底膜中NA-Fe(II)复合物转运蛋白。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：利用非洲爪蟾卵母细胞表达系统进行转运蛋白功能研究；通过放射性铁示踪技术和LC-MS定量分析NA外排；采用免疫组化和Western blotting分析蛋白表达和定位；使用定量RT-PCR检测小鼠小肠各段基因表达；通过分子动力学模拟研究NA-Fe(II)与LAT2的结合机制；使用免疫荧光显微镜观察蛋白在肠道组织中的分布。

研究结果

异二聚体氨基酸转运体LAT2/4F2hc增强非洲爪蟾卵母细胞中NA-Fe(II)的外排

研究人员靶向小肠基底膜中的氨基酸转运体，以鉴定NA-Fe(II)外排转运蛋白。异二聚体氨基酸转运体(HATs)是已知的转运氨基酸及其衍生物的家族，由重链亚基SLC3A2(CD98或4F2hc)和轻链亚基组成。研究人员选择了在小肠基底部位表达的人源y+LAT1/4F2hc(y+LAT1)、y+LAT2/4F2hc(y+LAT2)和LAT2/4F2hc(LAT2)进行研究。

当将NA-Fe(II)注射到表达LAT2的卵母细胞中时，观察到显著的外排活性，与注射NA时的活性相当。而其他转运体y+LAT2和y+LAT1没有显示任何显著活性。添加LAT2抑制剂BCH后，NA外排显著减少。这些结果表明LAT2/4F2hc在NA-Fe(II)外排中起关键作用。

非洲爪蟾卵母细胞中LAT2/4F2hc分布的免疫组化观察

通过使用抗LAT2和4F2hc抗体进行免疫组化分析，确认了LAT2在卵母细胞质膜上的表达。Western blot分析显示，在表达LAT2/4F2hc的卵母细胞膜组分中，出现了约50 kDa和120 kDa的条带，分别对应LAT2及其与4F2hc的复合物，而用4F2hc抗体染色的条带出现在约80 kDa处。这些结果与先前在小肠中观察到的LAT2/4F2hc复合物特征一致。

非洲爪蟾卵母细胞中表达LAT2/4F2hc或FPN1的铁外排

使用⁵⁹Fe同位素测量铁外排发现，在小肠基底膜表达的LAT家族成员中，LAT2在三种转运体中最有效地外排⁵⁹Fe。基于底物浓度依赖的外排，估算LAT2/4F2hc的酶活性为K_m=42 μM，V_max= 5.82 pmol/卵母细胞/小时。

比较LAT2/4F2hc和FPN1在铁外排中的效率发现，表达LAT2/4F2hc的卵母细胞在NA-Fe复合物注射后显示出比游离铁更高的铁外排，而表达FPN1的卵母细胞在游离铁注射后显示出比NA-Fe注射更高的铁外排。这表明NA-Fe复合物通过LAT2/4F2hc从基底膜运输到血管中，而与游离铁通过FPN1外排的机制不同。

小鼠小肠中Fe(II)或NA-Fe(II)转运相关基因的相对表达水平

为了阐明Fe(II)和NA-Fe(II)转运蛋白在小鼠小肠中的分布，研究人员分析了各转运蛋白的mRNA表达水平。将小肠分为10段，测量了LAT2和4F2hc mRNA相对于铁外排转运蛋白FPN1和铁存储蛋白铁蛋白的表达水平。

结果显示，LAT2和4F2hc在十二指肠中表达较低，而在近端和远端空肠中高表达。铁蛋白和FPN1在十二指肠(第1段)中高表达。NA-Fe复合物吸收转运蛋白(PAT1)和外排转运蛋白(LAT2/4F2hc)的基因表达在小鼠空肠中最高，而游离铁吸收(DMT1)、存储(铁蛋白)和外排(FPN1)相关基因仅在十二指肠中高表达。

小肠中LAT2/4F2hc分布的免疫组化观察

使用特异性抗体确认了LAT2和4F2hc在小鼠小肠近端空肠中的定位。使用villin(顶膜刷状缘标记蛋白)和上皮细胞粘附分子(EpCAM，小肠基底外侧上皮膜标记物)两种标记蛋白进行免疫荧光实验。结果显示，4F2hc和LAT2可能形成复合物，定位于近端空肠的上皮基底外侧膜，与基底外侧标记物EpCAM共定位。

LAT2突变对非洲爪蟾卵母细胞Fe(II)-外排活性的影响

根据先前的研究，构建了LAT2突变体Y131A、N134S和F243W。Western blot显示突变体间LAT2表达无显著差异。N134S突变体显著增加了⁵⁹Fe外排，而Y131A和F243W突变体的外排活性与对照无显著差异，这与先前使用苯丙氨酸和亮氨酸作为底物的突变研究结果一致。

竞争性抑制实验表明，添加20 mM苯丙氨酸(Phe)显著减少NA-Fe运输，而20 mM蛋氨酸(Met)无此效果。Lineweaver-Burk图表明，存在Phe(10 mM)时的K_m约是无Phe时的三倍，但两者的V_max非常相似，表明Phe可能是LAT2/4F2hc介导的NA-Fe外排的竞争性抑制剂。

LAT2/4F2hc-NA-Fe(II)复合物的分子建模

基于LAT2-4F2hc-色氨酸复合物的冷冻电镜结构，构建了LAT2/4F2hc-NA-Fe(II)复合物的结构模型。尽管色氨酸和NA-Fe(II)在结构上不相似，但NA-Fe(II)可以安全地放置在LAT2/4F2hc的底物结合腔中。

在500纳秒分子动力学(MD)模拟过程中，NA-Fe(II)在LAT2的腔内移动，而LAT2的跨膜螺旋几乎不从初始结构移动。MD结果表明LAT2/4F2hc的底物结合腔可以容纳NA-Fe(II)。在氨基酸突变实验中，显示增强铁外排活性的LAT2突变体N134的位置对应于腔入口附近，这种突变可能影响NA-Fe(II)的转运。

研究结论与意义

本研究提出了食物中NA-Fe吸收的可能机制：NA-Fe复合物通过肠道中的PAT1摄取，并通过基底膜中的LAT2外排到血液中。这条途径不同于游离铁的途径，后者涉及FPN1参与铁外排。

LAT2由12个跨膜结构域组成，通过二硫键与4F2hc重糖蛋白亚基结合，具有广泛的底物特异性，包括小的中性和极性不带电氨基酸。与专门在癌细胞中表达的LAT1不同，LAT2在人体中普遍表达。LAT2基因特异性地在小肠和肾脏中表达，表明NA-铁复合物可能以与氨基酸相同的方式被重吸收。

尽管游离铁离子具有高毒性，但摄取一定量的铁对生命至关重要。因此，通过摄取和外排维持特定的铁浓度对生物体很重要。DMT1/FPN介导的无机铁摄取受到肽类因子hepcidin的严格调控，而NA-Fe(II)/PAT1-LAT2通路是一条不受hepcidin调控的铁摄取通路。这种通路的存在可能在多样化供应路线方面具有生物学意义，但也可能使铁浓度的调控更加困难。

因此，hepcidin可能不调控铁摄取通路来摄取毒性较小的NA-Fe(II)形式进行铁运输。NA-Fe(II)通路的生理重要性以及LAT2/4F2hc在NA-Fe(II)外排到血液(和小肠)中的相关性是未来研究的主题。

这项研究不仅揭示了植物源铁在小肠中的新型吸收机制，还为开发针对铁代谢紊乱的治疗策略提供了新的靶点。由于NA在植物食物中含量丰富，使其在螯合治疗中具有应用潜力，避免了口服给药相关的副作用。对包括NA同系物在内的低分子量化合物的筛选可以模拟铁转运研究，有助于疾病治疗。

总的来说，这项研究深入揭示了植物源铁复合物在小肠中的吸收机制，发现了LAT2/4F2hc在NA-Fe(II)复合物外排中的关键作用，为理解铁代谢的复杂调控网络提供了重要见解，对改善铁缺乏性贫血和开发相关治疗策略具有重要指导意义。