揭示λ-卡拉糖降解的分子机制：Pseudoalteromonas distincta U2A的酶级联通路解析

本研究针对λ-卡拉糖（λ-carrageenan）——自然界中硫酸化程度最高的多糖之一——的微生物降解机制展开深入探索。研究人员通过结构生物学与生化分析相结合的方法，系统解析了Pseudoalteromonas distincta U2A菌株中由10种糖苷水解酶和5种硫酸酯酶组成的精密酶级联系统，首次完整揭示了λ-卡拉糖的降解通路。该研究不仅阐明了细菌利用高硫酸化多糖的分子基础，更为开发藻类生物质的高值化利用提供了酶学工具和理论支撑。

　　

在浩瀚的海洋中，红藻产生的卡拉糖类多糖是一类重要的生物资源，广泛应用于食品工业中的凝胶剂、稳定剂和澄清剂。其中，λ-卡拉糖以其极高的硫酸化程度（平均每个单糖携带1.5个硫酸基团）而著称，成为自然界中硫酸化程度最高的多糖之一。这种复杂的化学结构虽然赋予了λ-卡拉糖独特的理化性质，同时也使其成为微生物难以降解的"顽固"碳源。

尽管一些海洋异养细菌，特别是假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）的某些物种，能够有效代谢λ-卡拉糖，但长期以来，科学家们对其完整的酶学降解机制知之甚少。理解这一过程不仅有助于揭示海洋碳循环的微生物机制，更重要的是为开发藻类生物质的高值化利用提供关键的酶学工具。

在这项发表于《Journal of Biological Chemistry》的研究中，加拿大维多利亚大学的Alisdair B. Boraston教授团队通过对Pseudoalteromonas distincta U2A菌株的深入研究，首次完整解析了λ-卡拉糖降解的精密酶级联系统。

研究人员采用了一系列关键技术方法开展本研究：通过X射线晶体学解析了酶-底物复合物的三维结构；利用碳水化合物电泳（C-PAGE和FACE）分析酶解产物；采用毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF）和液相色谱-质谱（LC-MS）技术鉴定寡糖结构；通过半乳糖释放实验定量酶活活性；并运用AlphaFold2进行蛋白质结构预测。所有酶蛋白均通过异源表达系统制备，并进行了详细的生化表征。

PUL结构及细菌生长

研究发现U2A菌株的基因组中包含一个特殊的λ-卡拉糖特异性多糖利用位点（λ-CarPUL），该位点与先前在P. carrageenovora 9^T中报道的CarPUL具有同线性。生长实验表明，只有携带λ-CarPUL的U2A菌株能够在λ-卡拉糖作为唯一碳源的培养基中生长，而缺乏该位点的其他假交替单胞菌菌株则无法利用这种多糖。

初始λ-卡拉糖解聚

λ-CarPUL编码两个GH150家族糖苷水解酶（GH150A和GH150B），它们作为内切水解酶特异性切割λ-卡拉糖的β-1,4-糖苷键。虽然两者都能产生一系列偶数聚合度的λ-新卡拉寡糖，但GH150B能够产生不完全硫酸化的寡糖产物，表明其可能识别并切割λ-卡拉糖中硫酸化不完全的区域。

鉴定λ-新卡拉寡糖特异性外切半乳糖-2[,6]-硫酸-2-O-硫酸水解酶

通过筛选λ-CarPUL编码的五个硫酸酯酶，研究人员发现S1_8B能够作用于GH150B产生的寡糖库。晶体结构分析揭示S1_8B采用典型的S1家族碱性磷酸酶折叠，其活性位点能够识别非还原末端的α-连接的G2,6S（2,6-二-O-硫酸-d-半乳糖）残基，特异性去除2-硫酸基团。

末端α-连接半乳糖的水解依赖于2-O-去硫酸化

GH110A是一种外切-6-硫酸-α-d-半乳糖吡喃糖苷酶，需要S1_8B先去除非还原末端半乳糖的2-硫酸基团才能发挥活性。结构分析显示GH110A的活性位点能够紧密结合G6S（6-硫酸-d-半乳糖），并通过+1和+2亚位点与寡糖链中的2-硫酸化糖残基发生特异性相互作用。

鉴定λ-卡拉寡糖活性外切-β-d-半乳糖吡喃糖苷酶

GH2是一种β-半乳糖苷酶，但其活性完全依赖于S1_8C先去除非还原末端β-连接的G2S残基的2-硫酸基团。结构分析表明GH2的活性位点形成一个口袋状结构，其-1亚位点紧密围绕抑制剂分子，无法容纳硫酸化的半乳糖残基。

鉴定λ-卡拉寡糖活性外切半乳糖-2-硫酸-2-O-硫酸水解酶

S1_8C被鉴定为另一种λ-卡拉寡糖活性外切半乳糖-2-硫酸-2-O-硫酸水解酶。结构分析显示其能够识别末端β-连接的G2S残基，与S1_8B具有保守的S和0亚位点，但+1和+2亚位点存在显著差异，反映了它们对不同糖链构象的适应性。

鉴定外切半乳糖-6-硫酸-6-O-硫酸水解酶

S1_15A和S1_15B均被鉴定为6-硫酸-6-O-硫酸水解酶。结构分析揭示S1_15A具有封闭的活性位点，特异性作用于G6S单糖；而S1_15B的活性位点入口更为开放，能够容纳寡糖底物，且必须在S1_8B之后发挥作用。

GH110B是λ-新卡拉寡糖特异性α-半乳糖苷酶

GH110B是一种外切-α-d-半乳糖苷酶，其最佳活性需要S1_8B和S1_15B的预处理以完全去除非还原末端半乳糖的硫酸基团。结构分析显示GH110B的-1亚位点与未硫酸化半乳糖完美互补，与GH110A相比，其活性位点无法容纳6-硫酸基团。

鉴定单糖特异性半乳糖-2-硫酸-2-O-硫酸水解酶

S1_8A被鉴定为单糖特异性半乳糖-2-硫酸-2-O-硫酸水解酶。令人惊讶的是，研究人员意外捕获到了共价硫酸二酯中间体，为S1家族硫酸酯酶的催化机制提供了直接结构证据。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次完整揭示了λ-卡拉糖降解的精密酶级联系统，该系统由10种糖苷水解酶和5种硫酸酯酶组成，通过高度协同的顺序作用完全解构这种高度硫酸化的多糖。与先前报道的κ/ι-卡拉糖代谢途径相比，λ-卡拉糖降解途径使用完全不同的酶组，体现了酶学机制的显著特异性。

该研究的重要意义在于：首先，它提供了对海洋微生物降解高硫酸化多糖分子机制的深入理解，揭示了自然界碳循环的精细调控；其次，研究中对多种硫酸酯酶和糖苷水解酶的结构与功能关系的详细解析，为酶工程和蛋白质设计提供了宝贵的信息；最后，这些酶的发现和表征为开发基于酶法的藻类生物质高值化利用技术提供了关键的分子工具，在食品、医药和生物材料领域具有广阔的应用前景。

特别值得注意的是，研究人员在S1_8A的结构中意外捕获到了共价硫酸二酯中间体，这为理解S1家族硫酸酯酶的催化机制提供了重要线索。研究表明，硫酸酯酶可能通过多种机制实现S-O键的水解，这可能取决于离去基团的性质。

总之，这项研究不仅解决了λ-卡拉糖降解的酶学机制这一长期存在的科学问题，而且为利用酶法逻辑从丰富海洋资源（如红藻和其他工业相关亲水胶体生产者）生产高价值产品提供了新的机遇。