CNNM家族蛋白胞质结构域调控离子通道激酶TRPM7的机制研究

本刊推荐：为阐明TRPM7通道激酶活性在体内的调控机制，研究人员聚焦于跨膜蛋白CNNM家族与TRPM7的相互作用网络。通过生物化学定位和电生理分析，发现CNNM2的胞质结构域（CBS-pair和CNBH域）通过与TRPM7胞内区域的多位点结合，关键性调控其通道功能及激酶活性，并证实ARL15通过CBS-pair域抑制通道活性。该研究揭示了CNNM-TRPM7复合物调控镁稳态和疾病过程的新机制，为相关病理机制研究和靶点开发提供重要依据。

　　

在细胞生命活动过程中，镁离子（Mg²⁺）稳态的维持对众多生理功能至关重要。TRPM7作为一种独特的离子通道激酶，既是Mg²⁺、Ca²⁺和Zn²⁺等二价阳离子的通透通道，又具有蛋白激酶活性，参与从胚胎发育、免疫反应到癌症转移等多种生理和病理过程。尽管已知Mg²⁺、Mg·ATP等分子可直接调节TRPM7，但其在天然系统中如何被信号通路精确调控，尤其是激酶活性如何在体内被调节，仍不清楚。

近年来，研究发现CNNMs（CNNM1–4）家族蛋白可作为TRPM7的关键结合伴侣并调节其功能。CNNM本身参与Mg²⁺转运，且其结合蛋白如PRL（phosphatase of regenerating liver）和ARL15也参与TRPM7通道功能的调控。不过，这些分子之间具体的相互作用机制以及它们是如何协同调节TRPM7通道与激酶活性的，仍有待阐明。

为此，研究团队以CNNM2与TRPM7为模型，系统探索了二者间的相互作用机制。他们发现，CNNM2的氨基末端（含跨膜结构域）足以介导与TRPM7的复合物组装，而胞质内的CBS-pair和CNBH结构域则提供了额外的结合位点。电生理分析进一步表明，CBS-pair域参与调节TRPM7通道活性，并且是ARL15抑制通道功能所必需的。此外，CNBH域不仅能与TRPM7激酶结构域结合，还可以在体外轻微增强其催化活性。这些结果凸显了CNNM胞质结构域在双向调控TRPM7通道及激酶功能中的核心作用。该研究论文已发表在《Journal of Biological Chemistry》上。

为开展本研究，作者运用了分子生物学构建各类截短体和点突变质粒，通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down技术分析蛋白间相互作用；使用体外激酶实验检测TRPM7激酶活性及其对CNNM2的磷酸化修饰；通过全细胞膜片钳技术记录离子通道活性；并借助激光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位。部分细胞实验使用基因敲除细胞系（293-M7-ΔCNNM3/4）及 tetracycline 诱导表达系统。

CNNM2 NH₂-terminus和跨膜结构域介导CNNM-TRPM7复合物组装

研究人员通过Co-IP实验发现，CNNM2的氨基末端（含DUF21跨膜结构域）足以与TRPM7发生相互作用，而缺失CBS-pair或CNBH结构域并不影响这一结合。此外，激酶失活型TRPM7（K1646R）仍能与CNNM2结合，说明TRPM7激酶活性对其与CNNM2的组装不是必需的。

CNNM2胞质CBS-pair与CNBH结构域与TRPM7特定胞质区域发生相互作用

利用GST pull-down实验，作者发现CBS-pair域可与TRPM7的氨基末端和羧基末端区域结合，而CNBH域则特异性结合羧基末端。进一步细分TRPM7羧基末端区域显示，CBS-pair主要与丝氨酸/苏氨酸富集区（ST region）结合，而CNBH域除结合ST region外，还能直接结合激酶催化域（kinase domain）。

CNNM2的CNBH域调节TRPM7激酶活性并在体外被其磷酸化

体外激酶实验表明，CNNM2的CNBH域可轻微增强TRPM7激酶活性，且其本身可作为TRPM7激酶的底物被磷酸化。质谱分析鉴定出多个磷酸化位点，包括S726（71.5%磷酸化）、S783/S784和S819等。而CBS-pair域对激酶活性没有明显影响。

CNNM CBS-pair域调控TRPM7通道活性

在CNNMs敲除细胞中回表达CNNM2或CNNM4（包括其突变体如S269P或S196P）可恢复TRPM7通道活性。电生理记录表明，缺失CBS-pair域（ΔCBS）的CNNM2仍能恢复通道功能，但缺失CNBH域或携带T568I（导致CBS-pair构象改变）的突变体则不能。这些结果说明CBS-pair域可通过变构机制参与通道调控，且该过程不依赖Mg·ATP。

CNNM2 CBS-pair域是ARL15依赖性调控TRPM7所必需的

过表达ARL15可抑制TRPM7电流，但这一抑制效应在CNNM2缺失CBS-pair域（ΔCBS）或携带点突变（H523K）无法结合ARL15的情况下消失。证明ARL15通过结合CNNM2的CBS-pair域负调控TRPM7通道功能。

本研究系统阐释了CNNM2通过多个胞内结构域与TRPM7发生相互作用，并精细调控其通道与激酶活性的分子机制。特别是CBS-pair域作为“信号枢纽”，整合了来自ARL15等调节因子的信号，从而影响TRPM7的开放状态。这些发现不仅深化了对TRPM7在镁稳态和相关疾病中作用机制的理解，也为后续针对TRPM7–CNNM复合物的靶向药物开发提供了理论依据和实验基础。该研究成功填补了领域内关于CNNM调控TRPM7激酶活性及其分子结构基础的空白，具有重要的生理与病理意义。