DUF-721结构域与解旋酶装载蛋白DciA的N端延伸通过结合ssDNA促进新月柄杆菌复制性DnaB解旋酶装载的机制研究

本研究揭示了细菌复制性解旋酶装载的新机制。研究人员针对新月柄杆菌中DciA装载蛋白的DUF-721结构域开展功能研究，发现Arg106和Leu119残基对ssDNA结合至关重要，并通过N端延伸协同促进DnaB解旋酶拓扑装载。该发现阐明了DciA家族蛋白保守的ssDNA结合功能在细菌染色体复制起始中的关键作用，为理解不同细菌物种的解旋酶装载机制提供了重要见解。

　　

在细菌染色体复制过程中，复制叉的建立依赖于一个专门的分子系统，通过该系统，环状复制性DNA解旋酶被装载到染色体DNA上，促进双链DNA解旋为单链DNA。在大多数细菌中，DnaB解旋酶与其辅助蛋白DciA装载蛋白共同进化，DciA是含有未知功能域(DUF-721)蛋白家族的成员。在模型细菌新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)中，DciA促进解旋酶装载，而DUF-721的C端延伸作为同源DnaB解旋酶的特异性结合位点。然而，DUF-721在DnaB解旋酶装载中的机制作用仍然未知。

发表在《Journal of Biological Chemistry》上的这项研究为解决这一问题提供了重要见解。研究人员通过质粒互补实验、细菌双杂交系统和生化分析等方法，系统研究了DUF-721结构域及其N端延伸在解旋酶装载过程中的功能机制。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：细菌双杂交系统分析蛋白质相互作用、质粒互补实验验证体内功能、尺寸排阻色谱分析蛋白质寡聚状态、下拉实验检测蛋白质结合亲和力、ATP酶活性测定评估解旋酶功能、电泳迁移率变动分析(EMSA)检测ssDNA结合能力、体外解旋酶活性测定评估拓扑装载效率。所有实验使用的蛋白质样本均通过重组表达和纯化获得。

研究结果包括以下几个主要方面：

E. coli和C. crescentus DnaB蛋白与同源解旋酶装载器共享相同的接触表面

通过细菌双杂交分析，研究人员发现ccDnaB的LH-CTD结构域对于DciA相互作用至关重要。鉴定出Leu184、Val188、Phe305、Val308、Met313和Glu314等残基直接或间接参与DciA结合。这些残基的突变变体保持了形成寡聚体的能力，但显著降低了与sfTq2-DciA的亲和力。

确定DUF-721内的功能性DciA残基

质粒互补实验鉴定出Leu86、Arg106和Leu119是体内DciA功能必需的残基。Western印迹分析表明这些等位基因不改变DciA蛋白稳定性，支持这些残基在ccDnaB操作中发挥特定作用。

DciA Arg106和Leu119对ccDnaB结合是可有可无的

生化特征显示His-DciA(R106A)和His-DciA(L119S)变体保持了与ccDnaB-His的结合能力，ATP酶活性测定进一步支持这些变体维持了对ccDnaB-His的亲和力。

DciA Arg106对ssDNA结合很重要

EMSA实验证明野生型His-DciA与30-mer和80-mer ssDNA底物结合，而His-DciA(R106A)变体降低了ssDNA结合。在较高盐浓度条件下，His-DciA(L119S)变体也表现出对ssDNA的亲和力降低。

DciA (R106A)和DciA (L119S)维持对DnaB解旋酶活性的刺激

使用叉形DNA底物的体外解旋酶 assay显示，His-DciA(R106A)、His-DciA(L119S)和His-DciA(R106A L119S)变体保持了促进底物解旋的能力，表明这些残基对于与5' ssDNA尾的相互作用和稳健的叉 progression是可有可无的。

DciA (R106A)和DciA (L119S)损害ccDnaB的拓扑装载

使用气泡形DNA底物的解旋酶 assay表明，His-DciA(R106A)和His-DciA(L119S)变体在刺激ccDnaB-His的拓扑装载方面效果较差。使用M13环状ssDNA底物的 pulldown assay进一步验证了DUF-721介导的ssDNA结合在促进拓扑ccDnaB装载到ssDNA上的关键作用。

研究结论和讨论部分强调了这项工作的重要意义。研究发现DUF-721的ssDNA结合活性对于C. crescentus中的DnaB解旋酶装载至关重要。通过质粒互补实验，鉴定出DciA Arg106和Leu119是体内DciA功能必需的残基。生化分析显示这两个残基对于ssDNA结合和体外解旋酶装载很重要，但对于DnaB结合是可有可无的。此外，研究还揭示了DUF-721的N端延伸对于ssDNA结合和解旋酶装载至关重要。

这些发现表明，DciA通过DUF-721的ssDNA结合在拓扑解旋酶装载中扮演特定和保守的角色。与E. coli DnaC系统相比，DciA系统采用了一种不同的机制，其中ssDNA结合到DciA对于有效的解旋酶装载是必需的，但不同于DnaC或DnaI，DciA在装载后仍然与ccDnaB保持关联。这种相互作用可能在促进ccDnaB沿着染色体的后续转运中发挥积极作用。

该研究为理解细菌复制起始的分子机制提供了重要见解，揭示了DciA家族蛋白中保守的ssDNA结合功能在解旋酶装载过程中的关键作用，为开发针对细菌复制机制的新型抗菌策略奠定了理论基础。