基于脱氮黄素-重氮啶能量转移标记技术（DarT labelling）实现活细胞内高精度时空动态互作组测绘

为解决金属光催化剂毒性与长寿命活性中间体分辨率不足的问题，研究人员开发了有机脱氮黄素（deazaflavin）辅因子衍生物，通过三重态能量转移激活重氮啶（diazirine）产生卡宾，实现了细胞表面组和细胞内互作组的高分辨率测绘，为动态生物分子网络研究提供了强大工具。

　　

在细胞生物学研究领域，理解生物分子相互作用对于阐明疾病病理、发现生物标志物和开发治疗方法至关重要。邻近标记（Proximity Labelling, PL）方法结合质谱技术进展，已成为解密活细胞内蛋白质、RNA和DNA相互作用网络的强大工具。然而，传统方法如BioID缺乏时间控制，APEX需要H₂O₂处理影响细胞活性，而光催化邻近标记（Photocatalytic Proximity Labelling, PPL）虽具有短时间标记、可调标记半径等优势，但金属基光催化剂的固有毒性或长寿命活性中间体的较低分辨率限制了其细胞内应用。

针对这些挑战，研究人员在《Nature Chemistry》上发表了一项突破性研究，开发了一种基于有机脱氮黄素（deazaflavin）辅因子衍生物的新型光催化系统。这种衍生物通过三重态能量转移激活重氮啶（diazirine）产生卡宾（carbenes），具备优异的生物相容性和纳米级分辨率，实现了活细胞内外的高精度蛋白质互作测绘。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：1）光催化剂性能表征与机理研究，通过稳态/瞬态光谱分析能量转移效率；2）体外蛋白质光标记实验，使用Western blot和LC-MS/MS分析标记特异性和效率；3）细胞表面组测绘，通过HaloTag靶向系统和定量蛋白质组学；4）细胞通透性与生物相容性评估，采用改良氯烷穿透试验（CAPA）和细胞毒性测试；5）细胞内互作组分析，利用穿膜肽（CPP）偶联物和长时间动态追踪。

光催化剂性能与表征方面，研究人员首先评估了噻吨酮（thioxanthones）类三重态能量敏化剂，发现脱氮黄素4（deazaflavin 4）在PBS中15分钟蓝光照射下能完全转化重氮啶1，效率与铱催化剂3a相当。瞬态吸收光谱证实其通过Dexter能量转移激活重氮啶和芳基叠氮化物，而对酚类探针则通过单电子转移（SET）实现转化。

体外蛋白质光标记实验中，使用牛血清 albumin（BSA）和生物素-重氮啶探针8，Western blot显示脱氮黄素4与 eosin Y（EY）效果相当，但低于铱催化剂3a。LC-MS/MS分析人血清 albumin（HSA）标记位点显示，所有三种光催化剂均主要标记极性亲核残基如半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸。

细胞表面组测绘应用DarT标记技术，通过HaloTag-mGluR2融合系统，定量蛋白质组学分析发现169个显著富集蛋白（51个为细胞表面蛋白），与铱催化剂处理结果高度重叠，但脱氮黄素-氯烷13显示出部分细胞通透性。

脱氮黄素生物相容性与细胞通透性评估显示，即使在100μM高浓度下，HeLa细胞存活率>85%，显著优于细胞通透性铱催化剂3b（0.78μM即导致存活率<70%）。改良CAPA试验测定脱氮黄素-氯烷15的CP₅₀值为198±79.2nM（HeLa细胞），证明其良好的细胞通透性。

细胞内多聚精氨酸穿膜肽（CPP）互作组测绘中，线性（18）和环状（19）R₁₀ CPP衍生物均显示出与其亚细胞定位一致的互作蛋白富集：线性衍生物主要与溶酶体蛋白相互作用，而环状衍生物则与核仁蛋白相关。特别值得注意的是，ATP酶Na⁺/K⁺转运亚基β3（ATP1B3）在两种CPP中均显著富集，提示其在精氨酸富集CPP摄取机制中的普遍作用。

长达24小时的DarT标记实验成功追踪了环状R₁₀衍生物的细胞内运输轨迹，发现其从核仁定位逐渐转向溶酶体和外泌体相关蛋白富集，表明该肽段最终通过溶酶体胞吐作用排出细胞。这一发现为了解CPP的细胞内命运提供了重要见解，有助于其生物制药应用的优化。

研究结论与讨论部分强调，DarT标记技术作为一种强大而精确的方法，能够实现动态互作组的高分辨率测绘，有助于理解关键细胞内机制和复杂疾病相关生物分子网络。脱氮黄素4的优秀生物相容性和细胞通透性使其能够进行长时间细胞内PPL实验，这是细胞毒性铱催化剂无法实现的。虽然当前技术需要在光催化剂光稳定性和标记探针激活效率之间取得平衡，但未来开发吸收低能量波长（>600nm）的良性有机光催化剂，将有望在疾病特异性组织、类器官和活体生物中进行邻近标记研究。

这项研究由Leander B. Crocker、Jan Vincent V. Arafiles等研究人员共同完成，Roger Jan Kutta和Christian P.R. Hackenberger为通讯作者，为细胞生物学研究提供了新的技术手段和重要见解。