基于不对称CRISPR-Cas12a反式切割活性的“一锅法”快速结核病分子诊断新技术开发与临床验证

本研究针对现有CRISPR检测方法流程复杂、灵敏度不足且缺乏临床验证的问题，开发了一种名为ActCRISPR-TB的新型不对称CRISPR结核病诊断方法。该方法通过优化gRNA设计增强Cas12a反式切割活性，在60分钟内实现5 copies/μL的检测灵敏度，在603例临床样本中展现出93%的呼吸道样本灵敏度和64%的结核性脑膜炎检测率，特别在舌拭子样本中灵敏度达74%，显著优于现有方法。

　　

结核病(Tuberculosis, TB)至今仍是全球最致命的传染病之一，每年导致约1000万新发病例和160万人死亡，其中超过35%的新病例在低收入和中等收入国家得不到诊断。分子诊断技术的进步虽然显著改善了疾病诊断水平，但全球仍有一半人口难以获得这些检测，这掩盖了许多疾病的真实负担，特别是与贫困相关的疾病。

现有的CRISPR检测技术虽然能够快速检测病原体核酸，但存在明显局限性。传统的CRISPR检测通常需要两步法流程，先进行目标序列预扩增再进行检测，这不仅增加了操作复杂性，也带来了污染风险。特别是对于结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)这种在大多数诊断样本中DNA浓度较低的病原体，检测灵敏度往往不足。虽然有些研究尝试使用多个gRNA来增强报告基因切割和信号产生，但灵敏度提升有限。

为了解决这些挑战，研究人员开发了一种名为ActCRISPR-TB（不对称顺式/反式CRISPR结核检测）的新型诊断方法。该方法基于一个巧妙的设计理念：通过使用偏向反式切割而非顺式切割活性的gRNA，可以促进目标积累，从而驱动报告基因的反式切割，进一步提高检测灵敏度。

研究人员首先针对Mtb特异的插入序列IS6110设计了一系列gRNA，包括针对经典PAM（原间隔序列相邻基序）位点的gRNA-0和六个针对非经典PAM位点的gRNA（gRNA-1至gRNA-6）。通过系统评估这些gRNA的顺式和反式切割活性，他们发现gRNA-4、gRNA-5和gRNA-6能够差异性促进反式 versus 顺式切割，其中gRNA-5表现出最佳的反应动力学。

基于这些发现，研究人员优化了反应条件，最终确定了最佳参数：500 nM引物、16.8 nM Mg²⁺和40 nM RNP（核糖核蛋白复合物）。在36-40°C的温度范围内，该 assay 表现出稳定的性能，且与不同厂商的RPA试剂兼容。

在临床验证方面，研究团队收集了603份来自479名个体的临床样本，包括呼吸道样本、儿童粪便样本、成人脑脊液样本等。令人印象深刻的是，ActCRISPR-TB在呼吸道样本中的诊断性能与参考分子诊断方法相当，但在非呼吸道样本中的表现更优，特别是在舌拭子中显著增强了Mtb DNA的检测能力。

对于HIV阳性成年人的痰液样本，ActCRISPR-TB显示出80%的灵敏度，而Xpert MTB/RIF的总体灵敏度仅为40%。在支气管肺泡灌洗液(BALF)样本中，该检测方法识别了96%的细菌学确诊TB病例和21%的临床诊断TB病例，且所有非TB病例均为阴性。

特别值得关注的是，ActCRISPR-TB在舌拭子样本中的表现。通过对98名住院TB患者的前瞻性收集舌拭子进行分析，该方法显示出74%的灵敏度，显著高于Xpert Ultra的56%灵敏度。更重要的是，研究发现在早晨收集的拭子具有更高的信号和阳性率，这为采样时间优化提供了重要指导。

为了进一步简化检测流程，研究人员还将ActCRISPR-TB适配为侧向流动检测(LFA)格式，开发了适合现场使用的检测方法。这种改良的ActCRISPR-TB LFA工作流程包括10分钟的热/机械裂解步骤、45分钟的ActCRISPR-TB反应和2分钟的LFA孵育步骤，可通过视觉或智能手机读取结果。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下几种关键技术：首先是通过系统筛选和评估针对IS6110插入序列的多种gRNA，确定具有最佳不对称切割活性的gRNA候选物；其次是优化重组酶聚合酶扩增(RPA)和CRISPR反应条件，建立高效的一锅法检测体系；第三是使用临床样本队列进行验证，包括来自HIV阳性成年人、疑似TB儿童和疑似结核性脑膜炎成年人的多种样本类型；最后是开发侧向流动检测(LFA)格式，实现检测结果的视觉或智能手机读取。

ActCRISPR-TB开发与表征

研究人员通过详细表征不同gRNA的顺式和反式切割活性，发现gRNA-4、gRNA-5和gRNA-6能够差异性促进反式 versus 顺式切割。其中gRNA-5表现出最佳的反应动力学，基于此开发的一锅法ActCRISPR-TB检测在优化条件下表现出优异的性能。结构建模分析显示，不同Cas12a RNP的Cas12a和gRNA-模板异源二聚体结构相似，但非模板链在催化位点附近的相对位置存在差异，这可能影响其不对称切割活性。

ActCRISPR-TB诊断性能评估

在呼吸道样本方面，ActCRISPR-TB对成人呼吸道样本显示出93%的灵敏度，对HIV阳性成年人的痰液样本显示出80%的灵敏度。在非呼吸道样本方面，对儿童粪便样本显示出83%的灵敏度，对成人脑脊液样本显示出93%的灵敏度，并能检测64%的临床诊断结核性脑膜炎病例。特别值得注意的是，在前瞻性收集的舌拭子样本中，ActCRISPR-TB显示出74%的灵敏度，显著优于最敏感的参考检测方法。

舌拭子样本的ActCRISPR-TB诊断

研究发现，不同采集时间和保存条件会影响舌拭子样本的检测性能。早晨收集的拭子比晚上收集的具有更高的信号和阳性率。在Tris/EDTA缓冲液中保存的拭子在-20°C下储存1周仍能保持稳定的信号和阳性率，这为在实际应用中的样本保存提供了重要参考。

ActCRISPR-TB LFA诊断性能

研究人员成功将ActCRISPR-TB转化为侧向流动检测格式，简化了工作流程。该LFA格式使用简单的热/机械裂解程序生成可直接用于检测的样本裂解物，检测信号可通过LFA可视化。优化后的ActCRISPR-TB LFA与台式ActCRISPR-TB检测的灵敏度和特异性结果相当，为在资源有限环境中实施该检测提供了可能。

研究结论和讨论部分强调，ActCRISPR-TB assay 通过利用多个偏向反式 versus 顺式切割活性的RNP，成功增强了检测灵敏度和动力学。这种方法特别适合开发敏感、简化的现场检测方法，有助于在目前现代诊断服务不足的地区促进疾病诊断和管理工作，改善全球健康结局。

该研究的成功实施表明，基于CRISPR的分子诊断技术有望解决全球结核病诊断面临的挑战，特别是在资源有限地区。通过使用自收集舌拭子等非侵入性样本，并结合简化的检测流程，ActCRISPR-TB为扩大结核病筛查覆盖面、缩小病例检测差距提供了有前景的解决方案。

然而，研究也指出了一些局限性。尽管分析的TB队列试图覆盖疾病谱系并包括更难诊断的人群和表现，但某些组别的样本量相对较少。此外，在主要筛查无症状人群的社区主动TB检测工作中使用舌拭子的可行性仍需进一步评估，因为受影响个体主要具有低Mtb负担。

总的来说，这项研究为开发适用于偏远和资源有限环境的分子诊断提供了重要基础，特别是在改进疾病筛查至关重要的地区。ActCRISPR-TB assay 的成功开发不仅对结核病诊断具有重要意义，也为其他传染病的分子诊断技术开发提供了有价值的参考。