比率型近红外荧光探针实现线粒体多硫化氢成像以监测关节炎中的铁死亡过程

本研究针对关节炎中铁死亡（ferroptosis）过程中关键信号分子多硫化氢（H2Sn）的实时监测难题，开发了一种新型线粒体靶向比率型近红外荧光探针Cy-S4。该探针具有大斯托克斯位移（～218 nm）、超高灵敏度（检测限0.23 μM）和8秒快速响应等优势，成功应用于炎症细胞线粒体内源H2Sn的动态成像，并通过关节炎小鼠模型证实H2Sn在铁死亡中起关键作用。该研究为关节炎的诊疗提供了可靠的监测工具，丰富了相关理论基础。

　　

在生命活动的复杂调控网络中，活性硫物种（Reactive Sulfur Species, RSS）作为一类关键的含硫生物分子，近年来逐渐成为研究热点。其中，多硫化氢（H₂S_n, n>1）作为活性硫家族的重要成员，在细胞保护、信号转导、抗氧化及炎症反应等多种生理和病理过程中扮演着不可或缺的角色。与此同时，铁死亡（ferroptosis）——一种由铁依赖性脂质过氧化驱动的新型细胞程序性死亡方式，与多种人类疾病的发生发展密切相关。铁死亡过程中，活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）水平升高和脂质过氧化加剧，会进一步导致细胞内H₂S_n含量的增加。越来越多的研究表明，铁死亡与关节炎等疾病之间存在密切关联。然而，由于缺乏能够实时、特异、灵敏地监测H₂S_n，尤其是在其主要生成场所——线粒体内动态变化的工具，严重限制了对这些过程分子机制的深入理解。

为了解决这一难题，山西师范大学的曹婷研究员团队在《Technical Innovations》上发表了一项创新性研究。他们成功设计并构建了一种新型的、可靶向线粒体的比率型近红外荧光探针Cy-S₄，实现了对铁死亡过程中线粒体内H₂S_n的高性能成像，并将其应用于关节炎的监测研究。

研究团队主要运用了以下关键技术方法：基于半花菁（semi-cyanine）结构设计并合成了探针分子Cy-S₄；通过紫外-可见吸收光谱和荧光光谱系统评估了探针的光学性能；利用核磁共振氢谱（¹H NMR）、高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）等技术验证了探针与H₂S_n的反应机理；通过共定位实验（使用MitoTracker Green染料）证实了探针的线粒体靶向能力；采用细胞活力实验（MTT法）评估了探针的生物相容性；利用共聚焦显微镜进行了详细的体外和细胞内成像研究；通过构建脂多糖（LPS）诱导的小鼠关节炎模型，进行了深入的体内成像实验；采用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测了炎症因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）和铁死亡相关生物标志物（GSH, MPO）的水平；最后，通过苏木精-伊红（H&E）染色对探针的体内生物安全性进行了病理学评价。

3.1. 探针Cy-S₄对H₂S₄的光谱传感特性

研究人员首先在PBS缓冲体系中对探针的光学性质进行了详细表征。紫外-可见吸收光谱显示，Cy-S₄的最大吸收峰位于685 nm。当加入不同浓度的H₂S₄后，溶液吸收峰发生蓝移，并在365 nm处出现新的吸收峰且其强度随H₂S₄浓度增加而增强。荧光光谱结果表明，游离的Cy-S₄在728 nm处发射强烈的近红外荧光。加入H₂S₄后，728 nm处的荧光逐渐减弱，而在530 nm处的荧光发射显著增强，产生了显著的比率型信号（I_{530 nm}/I_{728 nm}）和巨大的斯托克斯位移（～218 nm）。在0–400 μM的H₂S₄浓度范围内，荧光强度与浓度呈现出良好的线性关系（R2 = 0.98），计算得出的检测限（LOD）低至0.23 μM。

3.2. Cy-S₄对H₂S₄的选择性和响应时间研究

动力学实验表明，Cy-S₄对H₂S₄的响应极其迅速，反应约8秒即可达到平衡，远快于此前报道的多数探针。选择性实验显示，探针仅对H₂S₄产生显著的荧光比率变化，而对包括其他活性硫物种（如H₂S, GSH, Cys）、活性氧、活性氮以及各种金属离子在内的31种潜在干扰物均无明显响应，表现出卓越的特异性。抗干扰实验进一步证实，即使在高浓度干扰物存在下，探针也能专一性地识别H₂S₄。

3.3. Cy-S₄与H₂S₄反应机理研究

基于H₂S₄强亲核性的特性，研究推测其会进攻探针半花菁结构中缺电子的C=N?双键，发生亲核加成反应。通过核磁共振氢谱滴定、高效液相色谱和质谱分析，证实了反应机理：H₂S₄攻击C=N?键，导致双键断裂，生成一个新的产物，其质谱信号与理论计算值相符，从而验证了所提出的反应机制。

3.4. Cy-S₄靶向细胞线粒体的实验探索

共定位实验是本研究的关键环节之一。使用商品化的线粒体染料MitoTracker Green与Cy-S₄共同孵育细胞，结果显示Cy-S₄发出的红色荧光与MitoTracker Green发出的绿色荧光高度重叠。经Image J软件分析，两者的皮尔逊共定位系数高达0.98，强有力地证明了Cy-S₄具有卓越的线粒体靶向能力，能够精准地富集于细胞线粒体中。

3.5. Cy-S₄在细胞中的共聚焦成像

3.5.1. Cy-S₄对细胞线粒体中H₂S_n的共聚焦成像

细胞毒性实验表明，即使在高浓度（100 μM）下，Cy-S₄的细胞存活率仍超过80%，具备良好的生物相容性。稳定性实验证明其荧光信号在细胞内能保持稳定。在加入外源性H₂S_n后，HeLa细胞中探针的红色通道（728 nm）荧光强度随H₂S_n浓度增加而减弱，绿色通道（530 nm）荧光强度则相应增强，成功实现了对细胞内H₂S_n的半定量比率成像。

3.5.2. 利用Cy-S₄对LPS诱导细胞内H₂S₄的共聚焦成像

脂多糖（LPS）能诱导胱硫醚γ-裂解酶（CSE） mRNA过表达，从而促进内源性H₂S_n的产生。实验发现，经LPS预处理的细胞，其红色通道荧光减弱，绿色通道荧光增强，比率值显著升高（～1.7）。而当加入活性氧抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）或硫醇抑制剂N-乙基马来酰亚胺（NEM）后，能够有效逆转LPS引起的H₂S_n水平升高，证实了Cy-S₄可用于监测由LPS诱导的内源性H₂S_n产生。

3.5.3. Cy-S₄在铁死亡过程中的细胞共聚焦成像

铁死亡诱导剂Erastin处理细胞后，显著降低了红色通道荧光，同时增强了绿色通道荧光，表明铁死亡过程导致了H₂S_n水平的上调。相反，加入铁死亡强效抑制剂Ferrostatin-1 (Fer-1)后，红色通道荧光恢复，绿色通道荧光减弱，证明Fer-1通过抑制铁死亡有效降低了H₂S_n的表达水平。这些结果明确显示Cy-S₄能够实时、有效地监测铁死亡过程中H₂S_n的表达变化。

3.6. Cy-S₄在活体器官中的病理学评价

为期7天的体内生物安全性评估显示，注射Cy-S₄的小鼠与注射PBS的对照组相比，体重变化无显著差异。对心、肝、脾、肺、肾等重要器官进行H&E染色分析，未观察到明显的组织损伤或炎症迹象，表明Cy-S₄具有良好的体内生物相容性和低毒性，适用于长期的活体成像研究。

3.7. Cy-S₄在铁死亡相关关节炎小鼠中的成像

研究最终在小鼠关节炎模型中验证了Cy-S₄的应用价值。实验分为空白组、对照组（仅Cy-S₄）、实验组（LPS+Cy-S₄）、炎症抑制剂组（NEM+Cy-S₄）和铁死亡抑制剂组（LPS+Fer-1+Cy-S₄）。体内成像结果显示，LPS诱导的关节炎模型小鼠其荧光信号显著增强，并在20分钟左右达到峰值。而炎症抑制剂NEM和铁死亡抑制剂Fer-1的干预，均能有效抑制荧光信号的增强。通过ELISA法对炎症因子（TNF-α, IL-6, IL-1β）和铁死亡标志物（GSH, MPO）的检测，进一步证实了关节炎模型与铁死亡相关的炎症状态的成功构建。这些结果表明，Cy-S₄能够高效、准确地监测关节炎模型中H₂S₄的表达水平，Fer-1的干预效果明确了铁死亡在该疾病中的调控机制。

综上所述，该研究成功开发了一种基于亲核加成机理、线粒体靶向的比率型近红外荧光探针Cy-S₄，用于特异性响应和检测H₂S₄。该探针具备大斯托克斯位移、近红外发射、高灵敏度、高选择性和超快响应等优异性能。它不仅能够在细胞水平上高效监测和成像铁死亡过程中H₂S₄的表达动态，验证其在LPS诱导的炎症细胞中的实时追踪能力，更重要的是，在与铁死亡相关的关节炎活体模型中展现了出色的成像性能。这项工作为深入研究H₂S_n在铁死亡及关节炎等疾病中的作用机制提供了强大的可视化工具，为相关疾病的诊断和新治疗策略的开发奠定了坚实的实验基础。