锌在公猪精子线粒体功能、运动性与质膜组织中的关键作用：揭示锌离子稳态对精子功能调控的分子机制

本研究针对公猪精子在体外环境中锌离子稳态对精子功能的影响机制展开深入探讨。研究人员通过添加不同浓度ZnCl2和锌螯合剂TPEN，系统评估了锌离子对精子线粒体功能、运动性、质膜组织及活性氧平衡的调控作用。结果表明：细胞外Zn2+通过剂量依赖性方式降低线粒体膜电位（MTP）并诱导活性氧（ROS）产生，而细胞内锌螯合则导致MTP下降和运动性受损。研究首次揭示锌与咖啡因在调控cAMP水平和膜流动性方面存在协同效应，为优化猪精液体存介质和体外受精体系提供了重要理论依据。

　　

在猪繁殖技术领域，精液保存质量和受精能力一直是制约产业发展的关键问题。公猪精浆中富含锌离子（约0.3 mM），这种微量元素的生理功能多年来备受关注。尽管已知锌参与精子发生、顶体反应和受精调节等多个关键过程，但其对精子基本功能维持——特别是线粒体功能、运动性维持和质膜组织方面的调控机制仍不明确。尤其是在体外处理过程中，精子脱离精浆环境后锌离子稳态的变化如何影响其功能完整性，成为研究者亟待解决的科学问题。

为此，德国弗里德里希-勒夫勒研究所的Katerina Marcollova团队在《Theriogenology》发表了创新性研究成果。研究人员采用化学限定培养基体系，通过精确控制锌离子浓度（0.01-2 mM ZnCl₂）和使用特异性细胞内锌螯合剂TPEN（0.0001-1 mM），系统分析了锌离子对新鲜公猪精子功能的影响。研究重点考察了线粒体膜电位（MTP）、运动参数、活性氧（ROS）水平、质膜流动性和cAMP浓度等关键指标。

关键技术方法包括：采用计算机辅助精子分析（CASA）系统量化运动性参数；运用流式细胞术多参数检测精子亚群功能状态（包括线粒体膜电位JC-1染色、锌离子荧光探针ZnAF、活性氧指示剂DHE/MitoSOX/DCF等）；通过cAMP ELISA试剂盒定量细胞内环磷酸腺苷水平；使用原子吸收光谱法测定培养基锌本底浓度。实验选用9头健康成年公猪（3头Leicoma、1头Pietrain、2头Large White、2头杂交种）的精液样本，所有射精样本均满足运动精子>70%、形态异常精子<25%的质量标准。

3.1 细胞外Zn²⁺对细胞内游离Zn²⁺水平的影响

研究发现，0.5-2.0 mM细胞外锌处理15分钟后并未引起细胞内游离锌水平显著升高。但30分钟孵育后，无锌或0.5 mM锌条件下的精子出现细胞内锌水平下调。使用锌离子载体pyrithione（25 μM）证实了ZnAF探针检测细胞内锌动态的有效性，表明公猪精子在体外环境中具有主动调节锌稳态的能力。

3.2 Zn²⁺、Ca²⁺或Mg²⁺对线粒体功能和膜完整性的影响

钙和镁离子对精子活力和顶体完整性无显著影响，而0.5-2.0 mM锌处理显著降低了存活且顶体完整的精子比例（PNA阴性），同时增加了存活但顶体改变的精子（PNA阳性）。更重要的是，锌处理以剂量依赖方式降低了存活精子线粒体膜电位，最高浓度（2 mM）使MTP降低达80%，而钙镁离子无此效应。

3.3 细胞外Zn²⁺对线粒体功能和精子运动性的影响

2 mM锌处理15和30分钟后均显著降低平均MTP和总运动力（下降约40%）。运动精子中的平均曲线速度（VCL）显著降低，而运动线性（LIN）增加。相关性分析显示MTP与总运动力之间存在显著正相关（15分钟r=0.62，30分钟r=0.71），证实了线粒体功能与运动性之间的紧密联系。

3.4 螯合游离Zn²⁺对线粒体功能和精子运动性的影响

使用TPEN螯合细胞内锌后，观察到MTP的剂量依赖性降低（10 μM TPEN即显效），但总运动力在大多数情况下保持不变。值得注意的是，最高TPEN浓度（1000 μM）导致侧向头部位移幅度（ALH）显著降低，表明即使运动力未明显下降，运动质量已受到影响。

3.5 细胞外Zn²⁺或锌螯合对运动性和活性氧产生的影响

锌添加引起早期胞浆和线粒体超氧化物水平降低，但同时伴随过氧化氢和羟自由基的剂量依赖性增加。TPEN螯合仅在长时间孵育后（30分钟）增加过氧化氢水平，对超氧化物影响较小。这表明锌离子在ROS平衡中扮演复杂角色，既参与超氧化物清除，又可能促进过氧化氢生成。

3.6 细胞外Zn²⁺对PNA阳性率和膜完整性的影响

锌单独处理不能增加高膜流动性精子比例，但与咖啡因（2-20 mM）联合使用时表现出显著协同效应，使膜流动性和cAMP水平大幅提升。锌处理引起少量但显著的存活PNA阳性精子增加，荧光显微镜观察证实这些精子顶体区信号较弱，不同于死细胞的强信号，表明锌可能诱导了顶体区膜的特定重组而非完全顶体反应。

研究结论强调，锌离子稳态对公猪精子功能维持具有双重重要性：过量细胞外锌通过降低MTP和改变ROS平衡损害运动功能；而细胞内锌耗竭同样损害线粒体功能。特别值得注意的是，锌与咖啡因在调控cAMP信号和膜流动性方面存在的协同效应，提示锌可能通过多途径参与精子功能调节。

讨论部分指出，精子线粒体对锌离子异常敏感，这种敏感性可能源于锌对线粒体酶系（如含锌超氧化物歧化酶SOD）的调节作用。锌诱导的过氧化氢积累与精子缺乏过氧化氢酶（catalase）的生理特性相吻合，说明锌稳态失衡可能通过氧化应激机制损害精子功能。研究还发现，不同公猪个体对锌处理的反应存在差异，提示遗传背景可能影响精子锌代谢特性。

这项研究的重要意义在于首次系统阐明了锌离子稳态在公猪精子基本功能维持中的核心作用，为优化精液体外保存体系提供了分子理论基础。研究结果提示，当前含EDTA等螯合剂的精液稀释液可能通过螯合锌离子而无意中损害精子线粒体功能，未来开发螯合剂减少或去除的稀释液配方可能有助于更好地维持精子功能完整性。此外，锌与咖啡因的协同效应为改善体外受精培养基提供了新思路，可能通过精确调控锌离子浓度和cAMP信号途径来提高受精效率。这些发现不仅对猪繁殖技术有直接应用价值，也为理解哺乳动物精子生理提供了重要见解。