PLP调控下的立体发散性转氨酶催化：动力学与热力学控制实现环己胺的高选择性合成

本研究针对单一催化剂难以实现动力学与热力学产物双向调控的挑战，开发了基于Vibrio fluvialis转氨酶(Vf-ATA)的生物催化新策略。通过调控PLP辅因子和丙氨酸浓度，成功实现了4-取代环己酮向顺式(kinetic)或反式(thermodynamic)胺产物的立体发散性转化，dr值最高达30:1，且该方法适用于2,3,4-多位点取代底物。研究还发现培养基中添加吡哆醇(PYP)可显著提升全细胞催化剂的holo-ATA含量和催化效率。该工作为手性胺类药物的绿色合成提供了新范式，发表于JOC期刊。

　　

在有机合成领域，选择性催化始终是化学家追求的核心目标。当反应同时存在动力学和热力学两种可能产物时，就为单一催化剂实现反应方向调控提供了独特机遇——通过控制反应条件，可以选择性获得其中一种产物。尽管这一理念在教科书上层出不穷，但在实际合成中却极少能完美实现。转氨酶(amine transaminases, ATAs)作为生物催化体系中的重要成员，因其能够高效合成手性胺类化合物而备受关注。这类化合物是众多药物分子的关键结构单元，例如 Ambroxol、Neltenexine 和 Cariprazine 等药物都含有环己胺结构。

然而，现有研究大多局限于利用转氨酶进行对映选择性反应，产生能量相同的对映体产物。对于可能产生能量不同产物的非对映选择性反应，特别是涉及环己酮类底物时，其立体发散性合成的潜力尚未得到充分探索。虽然前人研究发现某些转氨酶对4-取代环己酮的反应存在底物控制的选择性：大位阻取代基(如^tBu, Ph)主要得到顺式(cis)产物，而小位阻取代基(如甲基)则倾向于生成反式(trans)产物，但这些研究未能实现通过单一催化剂和简单条件调控来同时获得两种异构体。

为了解决这一挑战，来自戴维森学院化学系的研究团队在《The Journal of Organic Chemistry》上发表了他们的最新研究成果。他们开发了一种创新的生物催化方法，使用来自Vibrio fluvialis的转氨酶(V_f-ATA)，仅通过调节反应条件就能高选择性地生成顺式或反式环己胺。该策略不仅适用于4-取代环己酮，还成功扩展到2-和3-取代底物，甚至实现了动态动力学拆分过程，从外消旋酮底物直接获得对映体和非对映体富集的胺类产物。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：使用大肠杆菌表达系统制备野生型和突变型V_f-ATA全细胞催化剂；通过吡哆醇(PYP)补充培养策略增强酶蛋白的PLP辅因子结合效率；利用气相色谱(GC)和核磁共振(NMR)技术监测反应进程和立体选择性；通过紫外-可见光谱(UV-vis)分析PLP/PMP辅因子状态转换；采用蛋白质纯化和光谱定量方法评估holo-酶含量。

2.1. 4-取代环己胺的非对映发散性合成

研究人员以4-甲基环己酮(1A)为模型底物，使用表达野生型V_f-ATA的大肠杆菌全细胞作为催化剂进行反应。他们发现，在典型转氨酶反应条件(丙氨酸过量并添加PLP辅因子)下，反应转化率>90%，但非对映选择性较低(反式:顺式≈2:1)。通过系统优化，他们确定了两种关键反应条件：动力学条件(30当量丙氨酸，不添加外源PLP)主要得到顺式产物(95%转化率，30:1 dr)；热力学条件(2.5当量丙氨酸，添加0.1当量PLP)则得到反式产物(70%转化率，11:1 dr)。该方法成功应用于多种4-取代环己酮(1A-9A)，均能以良好至优秀的转化率和选择性获得顺式胺产物。

2.2. PLP在非对映发散性中的关键作用

研究发现PLP辅因子浓度对反应动态具有决定性影响。在热力学条件下，添加PLP显著促进了向热力学产物的平衡过程。值得注意的是，在细胞培养阶段添加PLP的前体吡哆醇(PYP)，能够提高转氨酶的表达量和holo-酶比例，从而增强催化活性和平衡效率。例如，4-苯基底物的dr从2:1提升至8:1(反式:顺式)。研究人员还筛选了多个ATA突变体，发现I259V和W57L突变能进一步提高反应效率和选择性。

2.3. 3-R-环己胺的非对映发散性合成

研究进一步扩展到3-取代环己酮，这类底物含有不可消旋化的立体中心。研究发现，(R)-3-甲基环己酮在动力学条件下主要生成反式(1R,3R)产物(95%转化率，18:1 dr)，而在热力学条件下则平衡为顺式(1S,3R)产物(62%转化率，11:1 dr)。对于3-三氟甲基和3-苯基取代底物，同样观察到了类似的非对映发散性行为，能够从单一生物催化剂获得所有四种可能的立体异构体产物。

2.4. 通过动态动力学拆分的对映选择性催化

对于2-取代环己酮，研究人员发现了动态动力学分辨率(DKR)过程。底物的α-手性中心在酶存在下能够快速外消旋化，使外消旋酮底物能够完全转化为单一立体异构体胺产物。通过H/D交换实验证实了酶催化下的α-质子交换过程。在最优条件下，2-甲基、2-乙基、2-烯丙基和2-苯基环己酮都能以良好至优秀的转化率和对映选择性获得反式胺产物，最高达到79%转化率，18:1 dr和>98% ee。

2.5. 导致非对映发散性的反应动力学解析

通过深入机理研究，研究人员发现顺式和反式胺产物在逆反应速率上存在显著差异：顺式-4-^tBu胺在5分钟内完全反应生成酮，而反式异构体反应速率慢得多。¹³C NMR研究表明，丙酮酸副产物被细胞快速代谢为碳酸氢盐和其他代谢物，而不是积累并促进逆反应。UV-vis监测显示，在热力学条件下，PLP辅因子的静息状态从PLP转变为PMP。这些数据表明，从动力学产物向热力学产物的异构化可能不完全是通过胺产物完全逆反应生成酮，而是通过胺产物与PLP辅因子重新反应形成醌型中间体，随后以差向异构化的形式释放胺产物。

研究还发现，使用纯化酶而非全细胞催化剂时，虽然能观察到类似的动态现象，但转化率显著降低，选择性也不如全细胞体系。这表明全细胞环境对于实现高选择性和高转化率的立体发散性合成至关重要，因为它允许反应在两种极端条件下成功进行：高丙氨酸/无PLP条件或低丙氨酸/高PLP条件。

该研究成功开发了一种基于单一转氨酶催化剂的立体发散性合成策略，仅通过调节PLP辅因子和丙氨酸浓度就能实现环己酮向顺式(动力学)或反式(热力学)胺产物的高选择性转化。这种方法适用于多种取代模式的环己酮底物，包括2-、3-和4-取代衍生物，并能够实现动态动力学分辨率过程。研究发现培养基中添加PYP可以显著提高转氨酶的表达量和holo-酶比例，从而增强催化效率。机理研究表明，立体发散性是通过复杂的反应动态实现的，涉及胺产物与PLP辅因子的再反应和差向异构化过程。

这项工作的重要意义在于首次实现了使用单一生物催化剂通过简单条件调控获得两种非对映异构体产物，为手性胺类化合物的绿色合成提供了新范式。该方法操作简单，选择性高，底物适用范围广，具有重要的合成应用价值。同时，该研究深化了对转氨酶催化机制的理解，特别是PLP辅因子在反应动态中的关键作用，为未来理性设计更高效的生物催化体系提供了重要 insights。这项研究不仅推动了生物催化领域的发展，也为药物化学中手性胺类化合物的合成提供了新思路和新方法。