海马神经元中STIM1与STIM2在ER-PM接触位点的活动依赖性动态定位与功能解析

本研究针对神经元内质网-质膜（ER-PM）接触位点中钙感应蛋白STIM1和STIM2的动态行为与功能机制展开深入探索。研究人员通过单粒子追踪技术发现STIM蛋白在静息状态下高度动态且回避突触区域，STIM2构成性聚集而STIM1仅在NMDA受体激活后与STIM2共聚集。该研究揭示了STIM蛋白通过调节ER-PM接触位点的尺寸与频率主导神经元内钙信号传导的结构性功能，且独立于Cav1.2通道活动。这一发现革新了对神经元钙稳态调控机制的理解，为突触可塑性及相关神经系统疾病的研究提供了重要理论依据。

　　

在人体的精密神经网络中，钙离子如同穿梭于城市街道的信使，承载着信息传递的重要使命。而内质网与质膜之间的特殊接触区域（ER-PM junctions），正是这些信使进行物资交换的关键枢纽。在这个微观世界里，STIM蛋白家族作为钙离子的敏锐"传感器"，掌控着细胞内钙库的平衡状态。然而，这些蛋白质在神经元这一高度极化细胞中的行为规律及其与突触功能的关系，始终是神经科学领域亟待破解的谜题。

以往研究表明，在非兴奋性细胞中，STIM蛋白通过激活ORAI通道介导钙库操纵性钙内流（SOCE），成为钙信号调控的核心机制。但在神经元这类具有复杂形态和功能分区的细胞中，电压门控钙通道和配体门控钙通道的多样性，使得SOCE的功能相关性存在争议。更令人困惑的是，神经元中ER-PM接触位点的面积占比高达10-20%，远高于非兴奋性细胞的1-2%，这一结构特点暗示STIM蛋白可能在神经元中扮演着比传统钙信号调控更为重要的角色。

为了揭开这一谜团，德国美因茨大学的研究团队在《Cell Reports》上发表了他们的最新发现。研究人员通过综合运用单粒子追踪（SPT）技术、CRISPR/Cas9基因编辑、钙成像和电生理记录等多种先进方法，对海马神经元中内源性STIM1和STIM2蛋白的动态特性进行了系统性研究。

该研究采用了三种实验策略： overexpression（过表达）、re-expression（重新表达）和CRISPR-Cas9介导的内源性标记。研究人员使用重组腺相关病毒（rAAVs）在神经元中表达N端Halo标签的STIM蛋白，并通过膜透性Halo配体与JF646荧光团结合实现单分子标记。通过实时追踪单个STIM分子的运动轨迹，结合突触前标记物synaptophysin-GCaMP6和突触后标记物PSD95.FingR-GFP，精确解析了STIM蛋白在神经元不同区域的动态行为。

研究团队还利用CRISPR-Cas9技术开发了ORANGE基因编辑工具箱，实现了内源性mStim1和mStim2蛋白的特异性标记，避免了过表达可能带来的实验偏差。通过免疫标记、共聚焦显微镜和光漂白分析等技术，研究人员进一步验证了STIM蛋白在ER-PM接触位点的聚集状态和分子数量。

STIM蛋白在树突和轴突中的动态特性

研究发现，STIM蛋白在神经元中表现出高度动态的特性，且在树突中的丰度高于轴突。在树突中，STIM2部分预聚集，而STIM1仅在ER钙库耗竭后形成聚集。STIM1在轴突中的移动性高于树突，而STIM2在轴突中的移动性甚至高于STIM1。通过使用Halo-TMC对照构建体（包含STIM1信号肽和ER transmembrane C末端）证实，树突和轴突中ER管状结构的差异并不是STIM扩散特性的主要影响因素。

STIM蛋白是突触的短暂访客

通过单粒子追踪和免疫标记实验，研究发现STIM蛋白很少定位于突触区域。尽管免疫标记显示STIM与突触标记物存在弱正相关，但Manders重叠系数较低，表明信号并非真正共定位。即使在ER钙库耗竭后，STIM在突触前和突触外区域的扩散特性也未改变，说明ER钙变化并不促进STIM的突触招募。

慢性和急性神经元活动变化改变STIM在树突中的动态

研究发现神经元活动的变化显著影响STIM的动态。增加网络活动（使用bicuculline）限制STIM1运动，而沉默网络活动（使用TTX）增加STIM1运动。短暂刺激谷氨酸受体诱导STIM在树突中聚集，但对轴突中的STIM移动性没有影响。NMDA受体激活通过触发ER钙释放（CICR）对谷氨酸诱导的STIM聚集至关重要。

谷氨酸诱导的STIM聚集不依赖于Cav1.2的活性

与先前研究不同，本研究发现Cav1.2通道的抑制或激活并不影响STIM的动态或NMDA诱导的ER钙耗竭程度。通过整体细胞膜片钳记录和钙成像实验，证实STIM蛋白不直接抑制Cav1.2通道，也不影响去极化诱导的钙内流。

STIM不局限于一种类型的接触

免疫标记显示，mStim1和mStim2簇的大小和形态与Kv2.1簇明显不同。STIM和Kv2.1信号之间只有弱正相关，且在ER钙耗竭后没有变化。使用ER-PM连接标记物MAPPER进一步证实，STIM2在静息条件下被限制在MAPPER斑点内，而STIM1在静息条件下在MAPPER斑点内外等量扩散，仅在NMDA受体激活后被招募到这些斑点中。

该研究得出了几个重要结论：首先，STIM蛋白在神经元ER膜中高度动态，并短暂局限于ER-PM连接处。STIM1和STIM2对ER内钙变化的敏感性差异反映在簇内分子数量和动态特性上。其次，NMDA受体激活是捕获STIM within ER-PM连接处的主要信号，而Cav1.2通道不影响STIM的局限化，也不在STIM聚集过程中发挥作用。

更重要的是，研究发现STIM蛋白主要位于轴突和树突的突触外区域，表明peri-synaptic ER-PM连接足以调节突触钙信号与ER钙库的耦合。STIM2主要维持ER-PM接触，而STIM1以活动依赖性方式扩大这些连接，这一过程即使在 prolonged NMDAR激活后也是可逆的。

这些发现革新了对神经元内钙信号调控机制的理解。STIM蛋白通过动态调节ER-PM接触位点的尺寸与频率，在神经元钙稳态维持中发挥着结构性功能，而不仅仅是传统的钙信号传导角色。这一发现为突触可塑性及相关神经系统疾病的研究提供了新的理论框架，也为未来开发针对钙信号异常相关神经系统疾病的治疗策略指明了新方向。

研究的局限性在于使用了培养的小鼠海马神经元模型，其生理相关性需要在体内研究中进一步验证。此外，STIM在抑制性神经元和兴奋性神经元中的差异表达表明，其功能可能具有细胞类型特异性，这为未来研究提供了新的探索方向。