核内cGAS协同CTCF重塑染色质空间结构 调控调节性T细胞发育与功能的新机制

本刊推荐：为解决cGAS在适应性免疫中的功能未知问题，研究人员开展T细胞内在cGAS-CTCF调控机制研究，发现核定位cGAS通过招募CTCF重塑Tnfrsf基因座染色质构象，独立于STING通路维持胸腺Treg细胞阳性选择及TNFRSF共刺激受体表达。Treg特异性cGAS缺失可破坏免疫抑制功能并抑制肿瘤生长，揭示了cGAS作为免疫耐受核架构师的全新功能。

　　

在免疫学领域，环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS)长期以来被公认是先天免疫中关键的胞质DNA传感器，当检测到微生物或异常双链DNA时，会催化合成第二信使2'3'-cGAMP，进而激活STING信号通路，诱发I型干扰素反应。然而近年研究发现，cGAS在多种免疫细胞核内大量存在，其功能远超出传统的DNA感知范畴。特别是在富含T细胞的淋巴组织中，cGAS的表达模式暗示其在适应性免疫中可能扮演重要角色，但这方面的功能却鲜为人知。

尤其令人困惑的是，CD4⁺ T细胞虽然表达cGAS，但其DNA感知能力却意外地依赖KU复合物而非cGAS。这种显著的分歧凸显了我们对cGAS在适应性免疫中功能认知的不完整性，特别是在CD4⁺ T细胞生物学中的作用。调节性T细胞(Treg细胞)作为免疫系统的“刹车装置”，在维持免疫耐受和防止自身免疫反应中至关重要，但其发育分化的精细调控机制仍有待深入探索。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，清华大学李宏鹏、张宇晨、高上泽和尹航团队揭示了cGAS在Treg细胞中的全新功能机制。研究人员发现，在稳态条件下，cGAS定位在Treg细胞核内，而初始CD4⁺ T细胞的刺激会诱导其转录并转位入核。通过使用T细胞和Treg细胞特异性cGAS敲除小鼠，他们证明核cGAS以不依赖其下游适配蛋白STING的方式促进Treg细胞发育和功能。

为开展这项研究，团队运用了多种先进技术方法：采用条件性基因敲除小鼠模型（包括Cd4Cre和Foxp3Cre-YFP系统）进行体内功能验证；通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)结合TCR测序分析胸腺细胞发育轨迹；利用ATAC-seq和CUT&Run技术评估染色质可及性和CTCF结合模式；运用原位Hi-C技术解析三维基因组结构；建立黑色素瘤小鼠模型评估体内免疫功能；并通过体外T细胞分化实验和免疫印迹等分子生物学方法验证机制。

研究结果首先显示cGAS缺失削弱稳态下调节性T细胞发育。通过刺激纯化的初始CD4⁺ T细胞(T_n)和CD8⁺ T_n细胞，研究人员发现Cgas表达在CD4⁺ T细胞中延迟诱导，而在CD8⁺ T细胞中迅速响应。核质分离实验进一步证实cGAS蛋白在CD4⁺ T细胞中呈现渐进性核定位，与CD8⁺ T细胞中的胞质表达模式形成鲜明对比。在cGAS缺陷型(Cgas^-/-)小鼠中，胸腺Treg细胞频率减少约40%，且这种缺陷扩展到外周淋巴器官。

cGAS维持Treg细胞发育的内在性通过竞争性骨髓嵌合模型得到证实。Rag1^-/-小鼠重建1:1混合的WT(CD45.1)加WT(CD45.2)或WT(CD45.1)加Cgas^-/-(CD45.2)骨髓后，Cgas^-/-区室中Treg细胞频率显著降低，证明cGAS在Treg细胞发育中的内在作用。值得注意的是，常规Cgas^-/-小鼠中Treg细胞减少的程度超过嵌合模型，脾脏Treg细胞频率显示4倍更大的耗竭。

cGAS在阳性选择中保护TCR信号以促进Treg细胞发育。研究人员基于CD69和TCRβ表达分析了胸腺细胞通过的四个定义阶段，发现cGAS缺失不改变整体阶段分布，表明总体阳性选择完整。但随着阳性选择在P2启动，cGAS缺失导致DPdim增加和CD4⁺CD8^lo减少，提示SP转换受阻。在P3和P4阶段，DP胸腺细胞百分比降低，暗示cGAS缺陷型胸腺细胞中激动剂信号强度减弱或克隆删除增强。

TNFRSFs表达对cGAS依赖性Treg细胞发育至关重要。研究发现c-Rel在cGAS缺陷型和WT preTreg和tTreg中被同等诱导，表明CD28共刺激信号充足。然而，DP胸腺细胞中CD69⁺OX-40⁺百分比降低，且OX-40表达自Treg前体阶段就开始减少。更成熟的标志物如CD25、NRP1和CD73在Treg发育后期阶段减少。CTLA-4的表达在preTreg和tTreg中也降低。

cGAS与CTCF合作调控Treg细胞染色质相互作用。ATAC-seq分析显示，cGAS缺陷型和WT preTreg细胞的全局染色质可及性相似，但在tTreg细胞中显著不同。ChromVAR分析显示CTCF、YY1和TCE3是可及性中排名最高的可变转录因子 motif。内源性共免疫沉淀(Co-IP)证实CTCF和cGAS之间的直接物理结合，免疫荧光进一步支持在Treg细胞中的核共定位。

cGAS缺失损害Treg细胞功能并增强抗肿瘤免疫。研究人员使用Foxp3Cre-YFP Cgas^fl/fl小鼠在Treg细胞中特异性删除cGAS，观察到脾脏和淋巴结中Treg细胞比例降低，而CD4⁺和CD8⁺ T细胞比例保持不变。在体外抑制实验中，cGAS缺陷型Treg细胞对CD8⁺ T_n细胞的抑制能力显著受损。在B16F10黑色素瘤模型中，Treg特异性cGAS缺失小鼠肿瘤生长显著减缓，生存期延长。

研究结论表明，在胸腺Treg细胞发育过程中，DP胸腺细胞接收更强的TCR信号并依次上调CD25和FOXP3成为成熟tTreg细胞。cGAS通过在阳性选择期间促进CTCF招募，特异性作用于Tnfrsf基因座，指导染色质相互作用的形成，增强Tnfrsf基因如Tnfrsf4的稳定转录。共刺激受体的上调可能提供额外的生存信号以防止Treg前体细胞凋亡。

这项研究的重要意义在于揭示了cGAS在适应性免疫中的非经典功能，确立了cGAS-CTCF轴控制Treg细胞介导的免疫耐受的新机制。这不仅扩展了我们对cGAS生物学 beyond先天免疫的理解，还揭示了其在维持免疫耐受中的意外核角色。研究发现4-1BB激动剂抗体可以扩展tTreg细胞，这对临床部署这些抗体增强抗肿瘤免疫提出了重要考量，需要仔细评估剂量依赖性效应和时间动态，以避免意外促进免疫耐受。

研究的局限性包括无法直接分析cGAS的基因组结合位点（缺乏商业可用的ChIP级cGAS抗体），未能区分Treg细胞功能损伤是cGAS缺失引起的发育缺陷还是内在抑制活性丧失，以及在体内评估CTCF对Treg细胞发育影响的技术挑战（小鼠纯合CTCF缺陷致死且T细胞特异性CTCF删除会阻断未成熟SP阶段的T细胞成熟）。

总之，这项工作重新定义了cGAS作为免疫耐受的核架构师，为理解Treg细胞发育的分子机制提供了新视角，也为肿瘤免疫治疗策略的开发提供了重要理论基础。