靶向5HT2CR调控脊髓运动神经元和中间神经元改善脊髓损伤后痉挛与疼痛的机制研究

本研究针对脊髓损伤（SCI）后常见的痉挛和神经性疼痛问题，通过腺相关病毒（AAV）介导的基因操作技术，在小鼠模型中选择性过表达5-羟色胺2C受体（5HT2CR），发现其在运动神经元（MNs）中过表达可显著改善运动功能并缓解焦虑抑郁样行为，而在谷氨酸能中间神经元（Glu INs）中过表达则能更有效缓解神经病理性疼痛。该研究为开发靶向5HT2CR的精准治疗策略提供了重要理论依据。

　　

脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是一种严重的中枢神经系统创伤，常导致运动、感觉和自主神经功能障碍。其中，肢体痉挛和神经性疼痛是SCI后最常见的并发症之一，严重影响患者的日常生活和康复训练质量。据统计，约三分之二的SCI患者在伤后六个月内会出现不同程度的肌肉痉挛，表现为肢体僵硬、睡眠障碍、痉挛性疼痛甚至瘫痪。目前临床上针对痉挛和疼痛的治疗方法主要包括保守药物干预和外科手术，但效果有限且存在明显副作用，因此亟需探索更有效的治疗策略。

近年来，5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5HT）系统在调节脊髓感觉和运动功能中的重要作用受到广泛关注。SCI后，5HT能神经纤维的损伤导致脊髓局部5HT水平下降，可能引起特定5HT受体的超敏或组成型激活，进而影响脊髓神经网络的功能状态。在多种5HT受体亚型中，5HT_2CR因其能够调节运动神经元的持久内向电流（Persistent Inward Currents, PICs）和神经元兴奋性，成为治疗SCI后痉挛的潜在靶点。然而，关于5HT_2CR在不同类型神经元中的具体作用及其机制尚不完全清楚，这也成为本研究关注的焦点。

为了深入探讨5HT_2CR在SCI后痉挛和疼痛中的作用，研究人员利用转基因小鼠模型和腺相关病毒（Adeno-Associated Virus, AAV）介导的基因过表达技术，分别在运动神经元（ChAT阳性）、GABA能抑制性中间神经元（VGAT阳性）和谷氨酸能兴奋性中间神经元（Vglut2阳性）中特异性过表达5HT_2CR，系统评估了其对痉挛样行为、运动功能、神经病理性疼痛以及情绪行为的影响，并进一步探究了其潜在的分子机制。相关研究成果发表在《iScience》杂志上，为开发针对SCI后并发症的精准治疗策略提供了重要的实验依据。

本研究主要采用了以下关键技术方法：首先，通过Cre-LoxP系统结合AAV病毒（血清型AAV2/BBB）实现5HT_2CR在特定神经元类型中的条件性过表达；其次，利用H反射（H-reflex）及其频率依赖性抑制（Rate-Dependent Depression, RDD）定量评估痉挛程度；第三，通过Basso小鼠评分（BMS）和DigiGait足迹分析系统评估运动功能和步态参数；第四，采用Von Frey细丝试验和热痛阈值测试评估机械性和热痛觉超敏；第五，通过开放场地试验（OFT）观察焦虑和抑郁样行为；最后，利用免疫荧光染色和Western blot技术检测关键蛋白分子（如KCC2、GABA_AR、NMDAR等）的表达变化。实验对象为C57BL/6N背景的转基因小鼠（包括ChAT-IRES-Cre、VGAT-IRES-Cre和Vglut2-IRES-Cre品系），所有动物实验均经相关伦理委员会批准。

AAV介导的5HT2CR在目标神经元中的过表达

研究人员首先构建了能够跨血脑屏障的AAV病毒载体（HBAAV2/BBB-CAG-DIO-m-Htr2c-3xflag-ZsGreen），该载体同时携带5HT_2CR基因片段和绿色荧光标记基因。通过尾静脉注射方式将病毒导入SCI模型小鼠体内，并利用免疫荧光技术验证了病毒在目标细胞（ChAT、VGAT和Vglut2阳性神经元）中的特异性表达。结果显示，病毒转染效率较高，且绿色荧光信号主要集中在于预期目标细胞中，表明AAV介导的基因递送具有较好的靶向性和有效性。

5HT2CR在MNs和INs中对痉挛的影响

通过H反射测试，研究人员发现SCI小鼠的RDD显著升高，表明其存在明显的痉挛样行为。而在过表达5HT_2CR的VGAT、ChAT和Vglut2组中，H波的振幅随刺激频率增加而显著降低，RDD得到明显改善。特别是在5Hz刺激频率下，VGAT组、ChAT组和Vglut2组的H波相对振幅均显著低于SCI组。这一结果表明，无论是在运动神经元还是中间神经元中过表达5HT_2CR，均能有效缓解SCI后的痉挛症状。

5HT2CR过表达对运动功能和步态动力学的调节

通过BMS评分和DigiGait步态分析，研究人员评估了5HT_2CR过表达对运动功能恢复的影响。结果显示，ChAT组和VGAT组小鼠的BMS评分显著高于SCI组，且步态参数（如站立时间、 stride频率等）也有明显改善。相比之下，Vglut2组小鼠的运动功能恢复较差，其步态周期和制动时间延长，表 明5HT_2CR在谷氨酸能神经元中的过表达对运动功能的改善作用有限。这一发现提示，5HT_2CR在运动神经元和GABA能神经元中的调控可能更有利于运动功能的恢复。

5HT2CR在Glu中间神经元中的过表达调节SCI后的机械和热痛阈值

通过Von Frey细丝试验和热痛阈值测试，研究人员发现Vglut2组小鼠的机械性和热痛阈值均显著高于SCI组，表明5HT_2CR在谷氨酸能神经元中的过表达能够有效缓解神经病理性疼痛。而在ChAT组和VGAT组中，疼痛阈值的改善并不明显。这一结果提示，5HT_2CR在不同类型神经元中的过表达对疼痛的调节作用存在差异，其中谷氨酸能神经元可能在这一过程中发挥更重要的作用。

5HT2CR在MNs或INs中的过表达调节GABAAR和KCC2的表达水平

通过免疫荧光和Western blot分析，研究人员进一步探究了5HT_2CR过表达的分子机制。结果显示，SCI后小鼠脊髓中NMDAR1和NMDAR2A的表达水平显著升高，而在ChAT组和VGAT组中，这两种受体的表达均有所下调。此外，5HT_2CR过表达还调节了KCC2和GABA_AR的表达：在ChAT组和VGAT组中，KCC2的表达呈上升趋势，而GABA_AR的表达则下降；相反，在Vglut2组中，GABA_AR的表达上升而KCC2的表达下降。这些变化表明，5HT_2CR可能通过调节氯离子稳态和突触抑制性信号，影响神经元的兴奋性和痉挛的发生。

讨论

本研究发现5HT_2CR在运动神经元中的过表达能够显著改善SCI后的运动功能、缓解痉挛及焦虑抑郁样行为，而在谷氨酸能中间神经元中的过表达则能更有效地缓解神经病理性疼痛。这些行为学改善与脊髓组织中KCC2、GABA_AR和NMDAR表达水平的变化密切相关，表明5HT_2CR通过调节这些关键分子的表达和功能，影响运动神经元的兴奋性和神经网络的活动状态。

从机制角度来看，5HT_2CR作为一种G蛋白偶联受体（GPCR），能够激活磷脂酶C（PLC）信号通路，调节细胞内钙离子浓度，进而影响神经元的兴奋性和突触可塑性。本研究还发现5HT_2CR过表达能够下调NMDAR的表达，这可能有助于减少兴奋性毒性信号和异常神经网络的重塑，从而改善运动功能和缓解痉挛。此外，5HT_2CR对KCC2和GABA_AR的调节作用也提示其在维持氯离子稳态和抑制性神经传递中的重要作用。

值得注意的是，5HT_2CR的mRNA编辑和组成型活性可能影响其功能发挥。RNA编辑能够抑制5HT_2CR的组成型活性，而本研究采用的AAV介导的基因过表达策略可能在一定程度上改变了5HT_2CR的活性状态，从而产生治疗效应。这也为解释以往关于5HT_2CR激动剂和拮抗剂在治疗痉挛和疼痛中效果不一致的现象提供了新的视角。

本研究的意义在于首次系统比较了5HT_2CR在不同类型脊髓神经元中的功能差异，并揭示了其通过调节KCC2、GABA_AR和NMDAR表达缓解SCI后痉挛和疼痛的分子机制。这些发现不仅深化了对5HT系统在SCI后神经网络重塑中作用的理解，也为开发针对特定神经元类型的精准治疗策略提供了重要的实验依据。未来研究可进一步探索5HT_2CR调控下游信号通路的具体机制，以及其与其他治疗手段（如康复训练、药物干预等）的联合应用效果，为临床治疗SCI后痉挛和疼痛提供新思路。