单细胞多组学揭示胚胎期肥尾形态发生中的多脂肪生成路径与多样化多谱系特化

本研究针对哺乳动物胚胎期脂肪生成机制不清的问题，通过单细胞多组学技术解析绵羊肥尾发育过程，揭示了脂肪沉积的多细胞起源和PPARG-DBI调控轴等关键机制，为理解脂肪组织发育和代谢疾病提供了重要 insights。

　　

脂肪组织作为人体重要的能量储存和内分泌器官，在维持代谢健康和系统能量稳态中发挥着至关重要的作用。然而，由于胚胎期脂肪组织取样困难、组织量少以及伦理限制等因素，哺乳动物胚胎期脂肪生成（adipogenesis）一直是脂肪生物学中了解最少的领域之一。与脂肪细胞体积增大（hypertrophy）相关的肥胖往往伴随着多种代谢综合征，而通过前体细胞招募产生新脂肪细胞的增生性脂肪生成（hyperplastic adipogenesis）则能够预防代谢疾病，并与胰岛素敏感性的维持密切相关。

近年来，随着单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术的发展，研究人员已经能够在高分辨率下解析组织的细胞组成和动态细胞状态。然而，将单细胞测序技术应用于脂肪组织仍面临巨大挑战——成熟脂肪细胞体积大、脂质含量高，难以进行常规的单细胞测序。虽然通过基质血管组分（SVF）提取或单核RNA测序（snRNA-seq）可以提供替代方案，但这些方法在数据整合过程中可能引入批次效应等假阳性结果。

与其它哺乳动物不同，肥尾绵羊在胚胎发生过程中进化出了独特的、遗传决定的尾部脂肪积累模式，尾部脂肪约占体重的10%。这一特点不仅对现代集约化生产系统提出了挑战，也为研究不受产后代谢影响的原位脂肪生成提供了独特机会。研究人员前期研究表明，在肥尾形态发生的初始和早期阶段（14-20 μm直径阶段）存在大量脂肪细胞，这为通过单细胞测序研究发育中的肥尾组织、揭示胚胎期脂肪生成的分子机制提供了可行性。

在这项发表于《iScience》的研究中，研究人员通过对胚胎期绵羊肥尾组织进行单细胞多组学分析，构建了包括转录组（scRNA-seq）和表观基因组（snATAC-seq）在内的全面图谱，涵盖了脂肪沉积的所有阶段（E50-E80）。研究采用了单细胞RNA测序、单核ATAC测序、RNA荧光原位杂交、原发性脂肪源性干细胞（ADSC）体外模型、双荧光素酶报告基因检测等关键技术方法，样本来自中国宁夏国家级滩羊保种场的绵羊胚胎。

研究结果展现了发育中绵羊肥尾组织的显著组织异质性。通过scRNA-seq和snATAC-seq图谱，研究人员识别出了37个细胞簇，注释为18种主要细胞类型，包括六种主要谱系：祖细胞、血管平滑肌细胞、脂肪生成、软骨生成、骨生成和肌生成谱系。祖细胞群体（包括祖细胞和干细胞PSC以及结缔组织祖细胞CTP）占总细胞的约40%，在所有时间点中比例稳定，突出了祖细胞在早期胚胎发育和组织生成中的关键作用。

在谱系层次结构方面，研究发现了脂肪生成的多细胞起源。大型祖细胞群体代表了多个谱系的多功能来源，包括表达TOP2A的PSC和表达COL6A6的CTP。研究人员定义了六个部分相邻的簇（PSC_C1至C6）和一个独立的肌生成祖细胞（PSC_Myo）簇用于PSC，以及三个紧密相邻的CTP簇（CTP_C1至C3）。通过RNA-FISH技术，研究人员观察到祖细胞群体在组织中的重叠空间分布，广泛分布在整个组织中。

血管平滑肌细胞（VSMC）分化研究揭示了脂肪细胞的细胞起源。研究发现前脂肪细胞有三个细胞来源：一个VSMC簇（VSMC_C2）、一个PSC簇（PSC_C4）和两个CTP簇（CTP_C2和C3）。位于血管中层的血管平滑肌细胞对于调节血管的收缩和扩张至关重要。研究人员观察到VSMC标记基因（GUCY1B1、AVPR1A、MYH11、ACTA2和TAGLN）和多能基因（TOP2A、TPX2和CKS2）在六个PSC簇中的PSC_C3中过表达。

多细胞类型对定型脂肪细胞的贡献方面，研究发现定型脂肪细胞（前脂肪细胞和脂肪细胞）通过PPARG、ACSL1、LPL和ADIPOQ基因进行注释，但不表达TRPV1和UCP1（分别是棕色脂肪细胞祖细胞和棕色脂肪细胞的标记物）。脂肪生成的两个阶段包括从祖细胞到前脂肪细胞的定型，以及从前脂肪细胞到脂肪细胞的分化。通过PAGA轨迹分析方法预测了与前脂肪细胞相关的三个脂肪生成祖细胞群体。

研究发现PPARG-DBI调控轴在脂肪生成中起关键作用。DBI（地西泮结合抑制剂）也被称为酰基辅酶A结合蛋白（ACBP），因其能够结合长链脂肪酰基辅酶A酯并介导脂肪酸终止和合成。在定型的脂肪细胞中，检测到DBI基因下游的一个特异性可及峰（Chr2:198163303-198163955），该峰可能与PPARG相互作用，可能代表一个推定的增强子。在原发性ADSC细胞模型中，DBI和PPARG在脂肪诱导后表现出表达持续增加，并呈现正相互关联。

微环境对脂肪生成的影响研究表明，白色脂肪组织（WAT）通过内分泌功能调节机体生理学的多个方面，同时微环境中的外部因素也能对新生脂肪生成和细胞命运决定产生影响。通过CellChat分析，研究人员推断并分析了所有细胞类型之间基于配体和受体对（LR对）差异表达的潜在细胞间通讯。

其他细胞谱系特化方面，研究发现在绵羊肥尾发育过程中也出现了骨生成、软骨生成和肌生成过程。前成骨细胞和成骨细胞特异性表达BMP3和BMP7基因，而不表达NGFR、MCAM、LEPR和NT5E基因，这与人类骨骼组织的细胞起源结果相似。

全局基因调控网络（GRN）分析表明，基于基因表达、染色质可及性和 motif 发现，研究人员使用单细胞调控网络推断和聚类（SCENIC）方法解读了每个谱系的增强子驱动的GRN（eGRN）。生成的eGRN显示了调节谱系特化的独特转录因子（TF）谱的富集。

研究的讨论部分指出，维持脂肪组织的动态平衡对于维持能量储存和消耗、支持脂肪组织功能以及预防代谢疾病至关重要。了解脂肪细胞在胚胎发生过程中的起源和发育层次结构是理解这些组织中观察到的多样性的关键。通过单细胞多组学技术对绵羊肥尾发育过程的研究，为理解哺乳动物胚胎期脂肪生成提供了新的见解，并揭示了控制谱系特化的关键基因。

研究的意义在于为研究哺乳动物产前脂肪生成提供了一个代表性的大型动物模型，为农业和生物医学领域的脂肪组织生物学研究提供了有价值的框架。发现的PPARG-DBI调控轴等功能重要性基因为控制脂肪沉积和脂肪组织发育提供了新的靶点，对理解肥胖和脂肪营养不良等人类代谢疾病具有潜在 implications。

研究的局限性在于结果主要基于生物信息学分析，虽然使用RNA-FISH进行了祖细胞的空间定位，但需要更精确的谱系追踪来明确确认细胞起源和分化途径。此外，PPARG-DBI调节子在哺乳动物脂肪生成中的保守性和功能作用需要进一步研究。