慢病毒载体介导的造血干细胞基因治疗恢复α-地中海贫血红细胞中α-珠蛋白表达

本研究针对α-地中海贫血主要类型（ATM）患者缺乏有效治疗手段的问题，开发了基于慢病毒载体（LVs）的造血干细胞基因疗法。研究人员通过构建携带HBA2基因的α-珠蛋白红细胞载体（EV-α和EV-α-UV），在ATM患者来源的造血干细胞中实现了高效的基因转导和特异性表达，成功恢复α/β-珠蛋白比例至治疗水平（>0.5），使血红蛋白产量提升50%-100%。该研究为ATM患者提供了一种潜在的自体干细胞基因治疗策略，具有重要的临床转化意义。

　　

α-地中海贫血主要类型（Alpha thalassemia major, ATM）是一种由于人类16号染色体上α-珠蛋白基因簇（HBA2/1）完全缺失导致的致命性遗传血液疾病。患者体内无法合成正常的α-珠蛋白链，造成α/β-珠蛋白比例严重失衡，继而引发胎儿期重度贫血、水肿甚至死亡。虽然近年来宫内输血（IUT）技术的应用显著改善了ATM患儿的生存率和神经系统预后，但存活者仍需终身依赖输血和铁螯合治疗，面临铁过载导致的多器官损伤风险。异基因造血干细胞移植（HSCT）虽是当前唯一根治手段，却受限于供体来源匮乏、移植物抗宿主病（GVHD）及化疗相关毒性等问题。

随着基因治疗技术的快速发展，基于自体造血干细胞（HSCs）的基因修饰为遗传性血液病提供了新思路。尤其在β-血红蛋白病领域，慢病毒载体（Lentiviral vectors, LVs）介导的β-珠蛋白基因疗法已取得重大突破，多项临床试验成功实现长期病情缓解，相关产品如Casgevy、Zynteglo等相继获批上市。然而，针对α-地中海贫血的基因治疗研究仍相对滞后。值得注意的是，α-地中海贫血患者只需恢复部分α-珠蛋白表达（使α/β-珠蛋白mRNA比值>0.2）即可脱离输血依赖，这为基因治疗提供了有利的窗口。

在此背景下，加州大学洛杉矶分校（UCLA）和旧金山分校（UCSF）的研究团队合作开发了靶向ATM的慢病毒基因治疗策略。他们设计了一系列α-珠蛋白红细胞载体（α-globin erythroid vectors, α-globin EVs），旨在通过自体造血干细胞移植（HSCT）恢复红细胞中α-珠蛋白的表达。该研究成果近期发表于《Cell Reports Medicine》，系统验证了候选载体在细胞模型、动物实验及ATM患者来源细胞中的有效性与安全性。

本研究主要采用以下关键技术方法：首先基于GLOBE和UV两种临床级慢病毒载体骨架，构建了包含不同调控元件的HBA2表达载体；利用CRISPR-Cas9技术构建α-珠蛋白双等位基因敲除（α-KO）的HUDEP-2细胞系用于体外筛选；通过体外红细胞分化体系培养健康供者及ATM患者来源的CD34⁺造血干/祖细胞（HSPCs）；使用液滴数字PCR（ddPCR）定量载体拷贝数（VCN）及珠蛋白mRNA表达；采用高效液相色谱（HPLC）分析血红蛋白四聚体及单珠蛋白链组成；借助免疫缺陷小鼠（NSG）模型评估移植后长期重建能力；应用单细胞RNA测序（scRNA-seq）解析红细胞分化的转录组特征；并对载体整合位点进行安全性评估。

设计α-globin EVs

研究人员设计了两组不同长度的慢病毒载体：一组基于GLOBE载体，包含2.6 kb的β-珠蛋白基因座控制区（β-LCR）（HS2+HS3），代表载体为EV-α；另一组基于更短的UV载体，包含1.2 kb的β-LCR（HS2+HS3+HS4），代表载体为EV-α-UV。所有载体均使用β-珠蛋白启动子驱动HBA2基因表达，部分载体还测试了α-珠蛋白启动子、HS40增强子、删除内含子或替换UTR等修饰策略。

在α-珠蛋白KO HUDEP-2细胞中的评估

在α-KO HUDEP-2细胞中，EV-α表现出最高的表达效率，其α/β-珠蛋白mRNA比值达到野生型水平，每VCN可产生30%的α-珠蛋白表达。HPLC分析证实EV-α能有效恢复α-珠蛋白链合成，使血红蛋白重建率达75%以上，并显著减少β-珠蛋白二聚体及血红蛋白H（HbH）的形成。

在健康供者CD34⁺ HSPCs中的表征

在健康供者来源的CD34⁺细胞中，EV-α和EV-α-UV均可实现高效转导（VCN≈5），α*/β-珠蛋白mRNA比值介于0.7–1.8之间。EV-α的表达效率更高（27% per VCN），且表达严格限制于红系细胞，在髓系细胞中未检测到泄漏表达。

在NSG小鼠中移植的HSPCs评估

移植EV-α或EV-α-UV转导的人CD34⁺细胞后，NSG小鼠骨髓中人源细胞嵌合率及谱系分布无显著差异。移植16周后，VCN维持在0.5–4.2之间，红细胞中α*/β-珠蛋白比值最高达0.83。整合位点分析显示载体呈多克隆分布，未发现与原癌基因相关的克隆扩增。

在ATM患者来源HSPCs中的挽救实验

来自三名ATM患者（骨髓、脐血及胎肝来源）的CD34⁺细胞经EV-α或EV-α-UV转导后，α/β-珠蛋白mRNA比值恢复至0.17–1.10（健康供者范围：0.88–2.50），血红蛋白产量达到内源性水平的50%–100%。单细胞RNA测序证实，转导后的红细胞中HBA2表达与健康供者相似，且铁离子结合通路等相关基因表达得以部分恢复。

本研究得出结论：EV-α和EV-α-UV慢病毒载体能高效转导人造血干细胞，并在红细胞中特异性恢复α-珠蛋白表达，重新平衡α/β-珠蛋白比例，实现功能性血红蛋白的合成。其中EV-α虽转导效率略低，但表达水平更高（接近单个内源性等位基因），而EV-α-UV则具有更高的病毒滴度和感染效率。两者在体内外实验中均表现出良好的安全性，整合谱系多克隆性且无致瘤风险。这些数据支持EV-α作为主导候选载体进入临床前研究阶段，为ATM患者提供了一种新的自体干细胞基因治疗策略。该研究不仅填补了α-地中海贫血基因治疗领域的空白，也为其他类型血红蛋白病的治疗提供了可借鉴的技术路线。