内质网连接点通过“停-走”运动切换调控内溶酶体互作的空间平台

本刊推荐：研究人员为阐明内溶酶体“停-走”式运动的调控机制，利用深度学习图像分析技术开展研究，发现内质网（ER）连接点通过VAP-STARD3-YWHAH通路介导肌动蛋白凝聚，调控运动切换并作为内溶酶体互作平台，破坏ER连接点将损害溶酶体成熟与运动性，该研究揭示了ER形态在细胞器空间协调中的核心作用，对理解神经退行性疾病病理机制具有重要意义。

　　

在细胞内部，内体（endosomes）和溶酶体（lysosomes）（合称内溶酶体endolysosomes）如同繁忙的物流中心，负责物质的运输、降解和回收。这些细胞器在细胞质中以一种独特的“停-走”模式运动，但其运动机制和调控方式长期以来并不明确。这种动态运动对于胆固醇稳态、细胞凋亡、代谢信号传递、外泌体释放以及质膜修复等关键细胞过程至关重要。然而，运动机制的失调与多种疾病相关，包括溶酶体贮积症、癌症和神经退行性疾病。因此，理解内溶酶体运动的调控机制，不仅具有重要的生物学意义，也为相关疾病的治疗提供了潜在靶点。

以往的研究表明，内溶酶体的运动主要依赖于微管骨架系统，由驱动蛋白（kinesin）和动力蛋白（dynein）分别介导双向运输。此外，肌动蛋白（actin）也参与调控内溶酶体的运动与定位。近年来，内质网（Endoplasmic Reticulum, ER）作为一种广泛分布的膜性网络，被发现在调控内溶酶体运动中扮演重要角色。ER与内溶酶体通过膜接触位点（Membrane Contact Sites, MCSs）相互连接，其中VAPA/VAPB（Vesicle-associated membrane protein-Associated Protein A/B）与ORP1L（Oxysterol-binding protein-related protein 1L）和STARD3（STAR-related lipid transfer domain protein 3）的相互作用，能够响应胆固醇浓度变化，调控微管依赖的内溶酶体运动。然而，内溶酶体的运动并非连续不断，而是以“停-走”模式进行，这种运动状态切换的时空调控机制仍不清楚。

ER网络由相互连接的管状结构和片层结构组成，并通过三向连接点（three-way junctions）相互联系。不同的ER结构域倾向于与特定细胞器相互作用，例如ER管状结构常与内溶酶体形成接触，促进其运动和管状分裂。ER连接点是脂质合成和钙离子交换的主要场所，其形成和维持依赖于Reticulon（RTN）、REEP家族和Atlastin（ATL）等蛋白。研究发现，ER网络结构紊乱会导致神经元中溶酶体增大且成熟度降低，而编码ER形态发生蛋白的基因突变与遗传性痉挛性截瘫（Hereditary Spastic Paraplegia, HSP）等神经退行性疾病相关，这些疾病中均观察到异常的内溶酶体结构。这些发现凸显了ER形态在细胞器通讯中的关键作用，但ER局部形状和整体网络完整性在其中的具体功能尚不明确。

为了深入探究ER网络如何调控内溶酶体的运动、相互作用及功能，研究人员结合基于深度学习的计算图像分析和活细胞成像技术，对COS-7细胞中内溶酶体相对于ER的动态过程进行了定量研究。他们发现，内溶酶体沿着ER管状结构运动，并经常在ER连接点附近暂停和受限，随后重新开始运动，这种过程被称为“停-走”运动切换。这种运动模式由ER网络和肌动蛋白细胞骨架的局部凝聚所介导，其中VAP-STARD3-YWHAH通路发挥了关键作用。内溶酶体的运动特性受到ER形态的调控，进而影响它们之间的相互作用频率，这对于内溶酶体之间的货物分选是必需的。此外，除了溶酶体和内体，其他细胞器如脂滴（lipid droplets）和过氧化物酶体（peroxisomes）也会在ER连接点附近暂停，这表明ER介导的机制可能普遍适用于细胞器“停-走”运动和相互作用的空间调控。

本研究主要采用了以下关键技术方法：利用活细胞荧光显微成像技术（如共聚焦显微镜）对表达ER（GFP-Sec61γ）、早期内体（BFP-Rab5）、晚期内体（mCherry-Rab7）或溶酶体（LAMP1-mCherry）标记物的COS-7细胞进行时序图像采集；基于深度学习的图像分析，包括粒子追踪、空间分布分析和ER形态学分析（如使用PE-Net模型进行ER图像分割，构建网络图以量化连接点密度、度中心性等参数）；采用Att-BiLSTM深度学习模型（结合隐马尔可夫模型-贝叶斯和长短期记忆网络）对粒子运动轨迹进行状态分类和切换检测；通过免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down实验验证蛋白质相互作用（如VAPA与STARD3、STARD3与YWHAH）；利用RNA干扰（RNAi）和CRISPR-Cas9基因敲除（KD/KO）技术（如针对VAPA、STARD3、ORP1L、YWHAH等基因）构建稳定敲低细胞系，以研究基因功能缺失对细胞器运动和接触的影响。

研究结果

内溶酶体在ER连接点处经历停-走运动切换

通过活细胞成像观察发现，内溶酶体沿着ER管状结构进行定向运动，并经常在ER连接点附近暂停和受限。最大强度投影分析显示，约90%的内溶酶体在ER连接点处暂停和受限。进一步的运动轨迹分析表明，ER连接点 consistently是内溶酶体重新开始定向运动的位点。为了定量确定溶酶体暂停和恢复运动的位置，研究人员利用单粒子追踪技术提取轨迹，并通过基于深度学习的图像分割方法表征动态ER网络。结果显示，暂停的溶酶体相对于邻近ER连接点的归一化距离平均为0.36，而理论随机暂停的期望值为0.5。此外，过氧化物酶体和脂滴的暂停也发生在ER连接点附近，其归一化距离分别为0.33和0.24，表明ER连接点是多种细胞器暂停的共性位点。

为了进一步确认ER连接点在暂停过程中的作用，研究人员分析了Atlastin 2和3双敲除（ATL DKO）细胞中ER连接点密度降低对溶酶体运动的影响。发现ATL DKO细胞中暂停的溶酶体不再局限于ER连接点，附近ER连接点暂停的溶酶体比例下降至75.3%。而过表达ATL3可恢复该比例至92.8%。过表达RTN4a（可稳定ER管状结构从而减少连接点）同样降低了溶酶体在连接点暂停的比例（78.9%）。RTN4a过表达结合ATL DKO则进一步将该比例降至61.7%。这些结果表明，ER连接点的形成和维持依赖于Atlastin和Reticulon等膜蛋白的完整性，并优先参与内溶酶体的暂停和运动重置过程。

停-走运动切换与ER连接点处 elevated 的密度和连通性相关

研究发现，约80%的内溶酶体在任何时间点都与ER保持持续接触。利用Att-BiLSTM模型对粒子运动轨迹进行分析，可将内溶酶体的周期性运动分为三种模式：快速、慢速和暂停。快速模式以大的扩散系数为特征，溶酶体以高瞬时速度探索不同区域但无明确方向性；慢速模式扩散系数小，粒子基本保持在相同区域；暂停模式需满足扩散系数小于0.01 μm²/s、保持在慢扩散状态至少20秒、运动限制在半径1 μm的圆内三个标准。约62.7%的溶酶体有两种运动模式，16.8%保持单一模式（多为慢速模式），20.5%表现出三种运动模式。内体也表现出不同的运动模式并发生运动切换，但转换频率较低。

为了探究ER形态如何影响个体内溶酶体的运动，研究人员分析了它们从运动切换到暂停过程中速度变化与局部ER形态变化的关系。通过在每个内溶酶体上中心化一个10像素（1.1 μm × 1.1 μm）的滑动窗口，量化了局部ER形态，包括ER密度和三个关键指标：连接点度（junction degree）、接近中心性（closeness centrality）、中介中心性（betweenness centrality），这些指标分别反映了ER网络的连通性、通信效率和节点影响力。参数根据其与溶酶体暂停和受限事件的相关性进行排序，平均排序得分分别为：空间密度68.9、连接点度66.1、接近中心性66.1、中介中心性58.1。运动切换位点的集中分布区域与ER密度图上 elevated 的空间密度区域相一致，表明ER连接点处网络密度和连通性的增加有助于内溶酶体的停-走运动切换。

ER连接点对溶酶体的模式化运动至关重要

通过ATL DKO或过表达CLIMP63人为改变ER连接点密度后，发现连接点密度降低导致溶酶体沿ER管状结构随机暂停，并增加溶酶体运动切换频率（ATL DKO增加19%，CLIMP63过表达增加约1.5倍），主要原因是慢速模式和暂停模式之间非定向循环的粒子数量增加（ATL DKO从7%增至13%，CLIMP63过表达从7%增至22%）。 consequently，溶酶体的位移减少（ATL DKO减少19%，CLIMP63过表达减少49%）。全细胞水平的均方位移（MSD）分析显示，与野生型相比，ATL DKO和CLIMP63过表达细胞中受限粒子比例分别增加15.9%和19.1%，定向运动粒子比例分别减少20.0%和49.2%。在细胞外周区域，单轨迹分析显示运动切换频率增加91%，受限粒子比例增加34%，定向运动粒子比例减少33%，位移减少47%。这些结果强调了具有 elevated 密度和连通性的ER区域在调控溶酶体停-走运动模式中的重要性。缺乏连接点时，溶酶体失去以受控方式停走的能力，导致运动效率降低。

停-走运动切换是内体-溶酶体相互作用的基础

内溶酶体系统的功能发挥，包括内体运输、物质导向降解或回收途径以及溶酶体酸化，需要粒子间动态且平衡的相互作用。活细胞成像显示，内体-溶酶体对通过定向运动相互靠近，相遇后通常在ER连接点处保持相对静止平均20秒，并常伴随分裂（fission），分裂后分离部分快速运动。相互作用对的平均速度为0.06 μm/s，分裂后速度增加4.2倍至0.24 μm/s。因此，运动切换贯穿于连接点处的整个相互作用过程。

研究人员开发了一种相互作用检测方法，利用K最近邻（KNN）算法识别选定轨迹的最近邻轨迹，仅持续超过4帧（8秒）的最邻近轨迹对被视为相互作用。检测到的相互作用与频繁的内溶酶体分裂事件相关，54.0%的分裂内体与溶酶体相互作用，其中10.2%的相互作用涉及内体和溶酶体的同时分裂。相互作用中心与连接点之间的距离几乎等于内溶酶体的直径。在ATL DKO细胞中，该距离约为粒子直径的2.6倍。相互作用对的另一个显著特征是它们相对静止。MSD分析显示，与个体内体或溶酶体轨迹相比，相互作用粒子行进距离最短，且超过90%保持静止状态。这些结果强调了运动切换过程对于内体-溶酶体相互作用的重要性。

ER连接点协调内体-溶酶体相互作用并与微管和肌动蛋白细胞骨架空间耦合

数据表明，ER的富集，特别是在连接点处，参与内溶酶体的运动切换和相互作用。因此，研究人员探究了广泛的ER网络是否在全局上调控这些运动切换事件并在全细胞水平同步内体-溶酶体相互作用。通过基于均值漂移（mean shift）的空间聚类分析发现，内溶酶体在细胞的核周和外周区域成簇聚集。相互作用率定义为相互作用事件数与总粒子数的比值。相对相互作用率（簇内与相邻非簇区域相比）显示，内体簇和溶酶体簇中的相互作用率分别增加1.5和1.4倍。而内体簇和溶酶体簇重叠的交集区域表现出最高的相对相互作用率（2.5倍）。在全细胞水平分析也得到类似趋势。因此，内体与溶酶体的相互作用与其空间密度相关。ER密度的增加也与簇的形成相关。

相互作用率也与溶酶体和内体的丰度密切相关，且符合二阶多项式模型。然而，在ER网络被破坏的ATL DKO细胞以及ER-溶酶体MCSs受损的VAPA KD细胞中，这种相互依赖性消失。这表明ER富集区域是内溶酶体成簇且相互作用更频繁的区域。

缺乏ER连接点可能会阻碍内溶酶体的成熟过程。对溶酶体酸性和蛋白酶活性（内体和溶酶体成熟的重要指标）的分析显示，ATL DKO和VAPA KD细胞中成熟形式的组织蛋白酶D（cathepsin D）减少，表明成熟过程受损。Magic Red（一种膜通透性组织蛋白酶底物）染色强度在ATL DKO和VAPA KD细胞中也显著降低，表明ER连接点的缺失影响了溶酶体的酸性和蛋白酶活性。

关于ER如何贡献于内溶酶体的停-走行为，研究发现微管和肌动蛋白细胞骨架在空间和功能上与ER相互连接以进行运动切换。共成像显示，虽然大多数溶酶体沿微管进行双向运动，但一部分也在检测不到微管的区域运动并停留。57.5%的ER连接点表现出微管富集，45.8%显示肌动蛋白富集。肌动蛋白解聚（使用细胞松弛素D或latrunculin）快速 disrupt 外周ER网络，而微管解聚（使用nocodazole）导致ER连接点减少较慢且不明显。操纵ER形态并未产生可检测的整体微管组织变化，突出了肌动蛋白依赖的ER形状维持和内溶酶体运动的作用。

YWHAH被VAPA-STARD3招募到ER-内溶酶体接触位点调控其运动性

除了与ER连接点的空间对齐，微管和肌动蛋白丝也通过分子机制（如驱动蛋白激活和肌动蛋白成核）功能性地贡献于溶酶体运动。一个突出的例子是ER管状结构与溶酶体之间的MCSs，它们在溶酶体运输过程中保留，并依赖VAPs作为栓系物招募马达蛋白。VAPA KD降低了溶酶体运动性，增加 constrained diffusion 粒子比例，减少 directed motion 粒子比例。同样，KD ORP1L（对动力蛋白介导的溶酶体微管运输至关重要）也损害溶酶体运动性。STARD3（接触位点的脂质交换介质）的缺失同样损害溶酶体运动性。只有STARD3的再表达能 rescue STARD3 KD引起的 increased confinement 并恢复 directed movement，而VAPA或VAPB的再表达能 rescue VAPA KD引起的 reduced lysosomal motility。

GFP标记的VAPA定位于整个ER并在溶酶体周围富集，而过表达显性负突变体VAPA^KDMD减少了在溶酶体上的积累。STARD3的接触缺陷突变体（STARD3ΔFFAT） disrupt 了其在溶酶体周围的定位。Protrudin表现出与STARD3相似的亚细胞定位模式。Co-IP实验进一步验证了STARD3与VAPA的相互作用，VAPA的MSP结构域能从细胞裂解液中 pull down GFP-STARD3。

对STARD3相互作用组的分析鉴定出酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白η（YWHAH），它是一个14-3-3蛋白家族成员，已知与肌动蛋白调节蛋白（如cofilin及其磷酸酶slingshot）结合，从而重组肌动蛋白细胞骨架。YWHAH RNAi phenocopies 了VAPA或STARD3 KD中观察到的溶酶体动态缺陷。Flag-YWHAH和GFP-STARD3能相互Co-IP。YWHAH弥漫分布于细胞质，但在76%的野生型细胞中，其富集于突出的 puncta，与UthCH标记的F-actin结构和溶酶体共定位。在STARD3 KO细胞中未观察到这种富集，溶酶体周围的肌动蛋白积累也缺失。时序成像显示，YWHAH逐渐积累在STARD3阳性的puncta上，这种积累与这些puncta的定向运动相一致。此外，在这些运动过程中，YWHAH在溶酶体上的富集与同一部位的肌动蛋白聚合同时发生。

将YWHAH靶向溶酶体促进肌动蛋白组装并部分挽救ER连接点或膜栓系缺陷细胞中的溶酶体动态和酸化

肌动蛋白彗星（actin comets）先前被描述为内源性细胞器的推进力，由N-WASP响应磷酸肌醇丰度或溶酶体 trapping 而成核。本研究观察到肌动蛋白彗星常在ER连接点附近富集，有时F-actin形成环绕ER多边形的环状结构。溶酶体在运动过程中与动态肌动蛋白积累共定位。用鬼笔环肽（phalloidin）染色肌动蛋白，用抗LAMP1抗体标记溶酶体，共聚焦显微镜成像显示，野生型细胞中肌动蛋白在溶酶体周围富集，而在ATL DKO细胞中未观察到。

用latrunculin destabilize 肌动蛋白丝导致ER网络崩溃并损害溶酶体动态。ER网络复杂性（量化为单位ER管状长度上的连接点频率）在latrunculin处理的细胞中减少24%。为了探究运动切换过程中肌动蛋白动态的作用，研究人员分析了持续超过10秒的加速和减速期，并量化了溶酶体上实时肌动蛋白组装。时滞互相关（TLCC）分析揭示了速度与肌动蛋白之间的先导-跟随关系：在持续减速期间，减速先于肌动蛋白变化；而在加速期间，肌动蛋白变化先于速度增加。在野生型细胞中，50%的溶酶体加速事件与肌动蛋白组装正相关。在ATL DKO细胞中，肌动蛋白的作用减弱，正相关比例降至10%，超过60%的加速事件与肌动蛋白动态弱相关。减速事件与肌动蛋白弱相关的比例从野生型细胞的30%增加到ATL DKO细胞的60%，强调了ER连接点在介导内溶酶体运动切换过程中肌动蛋白组装中的重要性。

对STARD3溶酶体定位的定量分析显示，89.8%的溶酶体表现出STARD3富集（富集指数>1）。这种积累高度依赖于与VAP蛋白的相互作用，删除FFAT基序产生了富集指数接近0的溶酶体次级群体。YWHAH RNAi适度降低溶酶体富集至68.0%。局部肌动蛋白富集 around 溶酶体显示出相似模式：在过表达GFP-STARD3的细胞中，75.7%的溶酶体显示局部肌动蛋白富集，该百分比在表达FFAT缺失突变体的细胞中降至43%，在YWHAH RNAi细胞中最显著地降至15%。动态相关性分析显示，在野生型细胞中，STARD3信号在加速期（61%正相关）和减速期（52%正相关）均与肌动蛋白正相关。而在GFP-STARD3 ΔFFAT突变体或YWHAH RNAi条件下表达的GFP-STARD3，其与肌动蛋白的相关性在加速期显著降低（分别降至17%和14%正相关）。

STARD3可被磷酸化，其FFAT基序内的Ser-209和Ser-213是潜在的磷酸化位点。但磷酸化缺陷或磷酸化模拟突变均不影响STARD3在溶酶体上的积累、肌动蛋白招募或其与YWHAH的相互作用。

研究人员假设MCSs处的YWHAH可能招募肌动蛋白以调控内溶酶体动态。他们将YWHAH与LAMP1人工融合，并评估了在过表达LAMP1-YWHAH或LAMP1的COS-7细胞中肌动蛋白焦点与溶酶体的共定位频率。表达LAMP1-YWHAH的细胞显示肌动蛋白彗星与溶酶体的共定位率（80%）高于表达LAMP1的细胞（70%）。MSD分析显示，在野生型细胞中过表达LAMP1-YWHAH（而非LAMP1）增强了溶酶体运动性，增加了定向运动粒子数量并延长了行进距离，并部分挽救了ATL DKO细胞中受损的溶酶体动态。这种不完全挽救可能归因于缺乏与ER连接点的接触。

VAPA、STARD3和YWHAH在功能上与溶酶体酸性和蛋白酶活性相关。过表达LAMP1-YWHAH-GFP部分恢复了ATL DKO细胞以及VAPA、STARD3、YWHAH缺失细胞中的Magic Red荧光强度。Western blot分析显示这些细胞中成熟形式组织蛋白酶D增加。这些发现表明，STARD3招募的YWHAH通过促进肌动蛋白组装，促进内溶酶体动态和成熟。

研究结论与意义

本研究系统揭示了内质网连接点作为关键调控中心，通过其独特的网络形态和VAP-STARD3-YWHAH信号通路，协调内溶酶体的“停-走”运动切换以及内体-溶酶体相互作用。研究发现：

1. 1.

   ER连接点是内溶酶体运动状态切换（暂停、受限、再启动）的主要位点，其高膜曲率和网络复杂性为运动切换提供了空间平台。

2. 2.

   VAPA-STARD3介导的ER-溶酶体膜接触是运动切换的核心分子机制，它们招募YWHAH，进而调控局部肌动蛋白的组装和动态，直接驱动运动状态的转变。

3. 3.

   这种运动切换机制对于内体与溶酶体的高效相遇、相互作用（包括膜融合、分裂和货物交换）以及溶酶体的最终成熟（酸化和蛋白酶活性）至关重要。

4. 4.

   该机制具有普遍性，不仅适用于内溶酶体，也调控脂滴、过氧化物酶体等其他细胞器的运动和暂停行为。

5. 5.

   破坏ER连接点（如ATL DKO）或干扰VAP-STARD3-YWHAH通路，会导致溶酶体运动紊乱、相互作用频率下降和功能受损，这为理解某些神经退行性疾病（如遗传性痉挛性截瘫、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默病）中观察到的内溶酶体功能障碍提供了潜在的细胞生物学机制。

该研究成功地将深度学习等计算生物学方法应用于复杂的细胞器动态分析，揭示了细胞内部不同膜系统（ER）与细胞骨架（微管、肌动蛋白）之间精密的空间协同机制，是细胞器生物学领域的一项重要突破。研究成果发表在《Science Advances》上，为后续针对相关疾病的机制研究和靶点开发奠定了坚实的理论基础。