基于全基因组测序探究乌鲁木齐地区结核分枝杆菌不同谱系毒力因子分布及其基因突变对治疗结局的影响

本研究利用全基因组测序(WGS)技术，系统分析了乌鲁木齐地区结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)不同谱系中毒力因子的突变特征及其与临床治疗结局的关联。研究发现谱系2中毒力基因espE、fadE29和mbtI的突变是影响治疗结局的危险因素(OR值分别为13.62、7.13和14.83)，为结核病的精准防治和毒力进化研究提供了重要依据。

　　

背景

结核病历来是严重威胁人类健康的重大传染病。随着分子生物学技术的发展，对结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的研究已从微观形态深入至分子特征层面，特别是对其毒力因子的探索。与传统病原体不同，MTB不依赖菌毛、鞭毛或毒素入侵宿主，而是通过引发强烈炎症和肺组织破坏，并巧妙操纵宿主巨噬细胞以躲避免疫应答。这一过程涉及多种毒力因子的参与，包括ESAT-6、sigE以及ESX-1至ESX-5分泌系统等。

MTB的毒力因子主要分为三类：分泌系统、细菌组分和相关酶类。分泌系统（ESX-1至ESX-5）负责转运多种毒力因子穿越宿主细胞膜，影响宿主免疫反应、破坏细胞完整性并最终导致细胞死亡。脂类毒力因子如Phthiocerol dimycocerosate（DIM/PDIM）可促进MTB通过吞噬作用进入巨噬细胞。此外，酶类如IpdAB参与固醇环水解过程，与MTB致病性密切相关。细胞壁成分、多糖和特殊蛋白也协助MTB的入侵和致病，但这些方面的研究尚不充分。

全基因组测序（WGS）和比较基因组学的进展使研究人员能够深入研究MTB毒力因子。不同MTB谱系中同一毒力因子的侵袭性和致病能力存在差异。谱系2和谱系4是全球最流行的谱系，其中现代北京基因型（谱系2）以高毒力和耐药性著称，而谱系4则具有广泛的传播能力。其他谱系则呈现不同程度的地域隔离特征。这些差异源于MTB毒力因子在不同地区人类宿主中的进化适应。多种谱系共存的区域为优势基因的流动和遗传漂变提供了有利条件，可能通过适应性进化进一步促进毒力因子发展。

中国作为结核病高负担国家，MTB主要通过三条路径传入：俄罗斯远东地区（进入中国东北）、海上丝绸之路（通过东南沿海进入内陆）以及陆上丝绸之路（经新疆到达内陆和沿海地区）。新疆作为西北重要交通枢纽，连接中国与中亚、欧洲，人口流动与贸易活动频繁，为MTB的传播及不同谱系间的基因流动创造了条件。因此，研究多谱系共存区域的毒力因子对预测MTB的进化方向、传播力、耐药性及致病性具有重要意义。

材料与方法

本研究采用回顾性设计，利用乌鲁木齐市2017年1月1日至2021年12月31日期间国家耐药监测数据，共收集457例结核病患者痰样本中的MTB菌株进行全基因组测序。样本量估算显示本研究样本量满足统计学要求。患者基本信息来源于国家耐药监测数据库（NDRS），涵盖人口学、流行病学及临床资料。

菌株分离培养采用固体培养法，使用酸性Lowenstein-Jensen（L-J）培养基，37°C恒温培养。菌株鉴定使用对硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸肼鉴别培养基。DNA提取采用膜吸附柱法和PureLink?微生物组DNA纯化试剂盒，质量评估通过琼脂糖凝胶电泳和Qubit定量完成。建库使用NEBNext?Ultra? DNA Library Prep Kit，在Illumina PE150平台进行测序。

数据分析使用FastQC进行质控，Trimmomatic处理低质量片段。以H37Rv（NC_000962.3）为参考序列，Snippy软件进行变异检测、核心基因组比对和SNP calling。系统发育重建使用IQ-TREE软件，采用最大似然法构建进化树，bootstrap重复10,000次。谱系鉴定使用TB-Profiler软件，毒力因子识别使用Abricate软件。

统计分析方法包括χ2检验、校正χ2检验、Fisher精确检验用于分布差异分析和单因素分析；多因素logistic回归模型和广义多因子降维模型（GMDR）用于多因素分析和基因-基因交互作用分析。此外，利用RNArtist和SWISS-MODEL预测核苷酸和蛋白质二级结构，PROVEAN PROTEIN预测蛋白质功能，PyMOL进行可视化。

结果

基本信息

共分析457例结核病患者，男性占比59.96%，女性40.04%。65岁及以上患者占39.61%。职业分类中服务业人员占比最高（38.51%），其次是退休人员（28.01%）。86.00%患者居住于 urban areas，77.90%为非迁移人口。86.87%患者为初治患者，13.79%治疗失败（包括转入耐多药治疗、失访及其他疾病死亡）。所有患者均有卡介苗接种史，2例患者合并营养不良，治疗期间未使用免疫抑制剂。

毒力因子突变分析

与毒力因子数据库（VFDB）比对共鉴定71种毒力因子，覆盖H37Rv标准株83种毒力因子的85.54%。其中23种毒力因子突变率高于56.24%，48种低于16.19%。9种毒力因子（ESX-1、ESX-2、ESX-3、Mce1、Mce2、Mce3、NuoG、PDIM和PhoP）突变率达100.00%。不同MTB谱系间27种毒力因子突变率存在显著差异（p<0.05）。谱系2中LipF和Mce4突变率至少是谱系3和谱系4的两倍；谱系3中ABC转运蛋白、抗原85、DevRS、脂质磷酸酶和PE/PE-PGRS突变率是谱系2和谱系4的三倍；谱系4中硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白、色氨酸合成和酪氨酸磷酸酶突变率是其他谱系的三倍。所有谱系2菌株均属于北京家族，其中L2.2.1亚型突变率（60.56%）高于L2.2.2。

毒力因子相关基因突变分析

根据VFDB分类，211个毒力基因分为四类：防御性毒力因子（50.71%）、进攻性毒力因子（34.60%）、毒力相关基因调控（7.11%）和非特异性毒力因子。根据PHI-base数据库分类，毒力增加（超毒力）、效应子（植物无毒决定子）、毒力降低、不影响致病性和未知功能分别占2.37%、3.79%、3.32%、1.42%和89.10%。谱系2和谱系3中nuoG基因、谱系3和谱系4中eccE3和PE35基因、谱系3中eccA2、eccA3和mycP4基因突变率达100%。86个基因的突变率在三种谱系间存在显著差异（p<0.05）。谱系2中33个毒力相关基因（如PE5、PPE4、PPE41）突变率不低于其他谱系；谱系3中33个基因突变率 similarly较高；谱系4中仅20个基因突变率不低于其他谱系。

毒力因子基因突变对治疗结局的影响

为探究不同谱系中毒力因子相关基因突变对患者治疗结局的影响，分析了211个毒力基因。考虑到耐药基因可能对结果造成干扰，采用倾向评分法控制耐药基因影响。结果显示谱系2中耐药基因倾向评分分布在治愈组与未治愈组间存在显著差异（t=-2.6174, p=0.0115），而谱系3（t=-0.822, p=0.4166）和谱系4（t=-1.9374, p=0.0749）无显著差异。

单因素分析发现谱系2中PPE26、espE、fadE29、lipF、mas、mbtB、mprB、mmpL10、mbtI、aftB、ppsA、eccC4等基因突变与治疗结局相关，其中eccC4和ppsA分别为缺失变异和MNP变异，其余为SNP变异。未发现插入变异和复杂变异分布差异。谱系3中eccE2、purC和PPE68基因影响治疗结局。谱系4中未发现毒力相关基因突变对治疗结局的影响。

多因素logistic回归分析显示，谱系2中espE、fadE29和mbtI基因突变是治疗结局的危险因素。与未突变组相比，突变组未治愈的相对风险分别提高13.6200倍（1.7285–107.3201）、7.1262倍（1.3294–38.1997）和14.8340倍（1.1577–190.0784）。GMDR模型分析未发现这些基因间存在交互作用。核苷酸二级结构预测显示突变型较野生型发生不同程度改变。蛋白质三维结构预测显示各突变位点氨基酸多数位于氢键连接处（除espE基因P223R和Q362R、fadE29基因A202G外）。功能预测显示fadE29基因R46Q和T139S为有害突变，其余为中性突变。

谱系3多因素分析模型有统计学意义（χ2=13.9472, p=0.0030），但eccE2、purC和PPE68基因在多因素分析中无统计学意义（p>0.05）。

讨论

结核病防治仍是全球重大公共卫生问题。为实现世界卫生组织（WHO）2035年消除结核病的目标，必须深入研究MTB的传播性、致病性和耐药性。不同结核菌株的传播、致病和耐药性与其毒力因子的变异和进化密切相关。

本研究通过WGS和生物信息学分析，发现乌鲁木齐地区MTB毒力因子存在广泛突变，71种毒力因子中有23种突变率较高，9种达100%。这些高度突变的毒力因子涉及分泌系统（ESX-1、ESX-2、ESX-3）、MCE操纵子（Mce1、Mce2、Mce3）、抗凋亡因子（NuoG）、细胞表面成分（PDIM）和调控因子（PhoP），与MTB的致病性、感染性或耐药性相关。研究表明ESX-1通过重塑细胞内环境促进病原体复制，破坏吞噬体膜并激活免疫感应通路；ESX-3参与金属稳态，突变导致铁摄取缺陷；ESX-5系统对生长和毒力至关重要；MCE复合物协助脂肪酸和胆固醇跨膜运输；NuoG与bedaquiline和clofazimine耐药相关；PDIM抑制巨噬细胞炎症反应；PhoP在PhoPR双组分系统中关键作用失活会显著降低MTB增殖能力。

不同谱系间毒力因子突变率存在显著差异。谱系2中LipF和Mce4突变率较高，与其公认的高毒力和传播性一致。LipF调控巨噬细胞pH值，为MTB生存提供更有利环境；Mce4参与宿主细胞粘附和进入。谱系3中ABC转运蛋白、抗原85、DevRS、脂质磷酸酶和PE/PE-PGRS突变率较高，该谱系主要分布于印度和中亚，可能在多药耐药结核传播中起关键作用。谱系4中硝酸盐/亚硝酸盐转运蛋白、色氨酸合成和酪氨酸磷酸酶突变率较高，这些突变与耐药性相关，需警惕新型耐药菌株出现。

谱系2内部L2.2.1亚型毒力因子突变率高于L2.2.2，表明乌鲁木齐地区以祖先北京亚型为主，可能存在向现代北京亚型的转变。新疆多谱系共存和频繁人口流动为这一转变提供了条件，需采取积极防控措施。

毒力因子相关基因分析显示，防御性毒力因子相关基因突变占比最高（50.71%），表明MTB可能向适应人类宿主方向进化。但PHI-base分类中89.10%基因功能未知，揭示了对细菌-宿主相互作用理解的重大空白。7个毒力因子相关基因（nuoG、eccE3、PE35、eccA2、eccA3、mycP4、mce2A）在所有样本中均突变，其中nuoG在谱系2和谱系3中突变率100%，可能与新型抗结核药物耐药相关；eccE3和PE35在谱系3和谱系4中突变率100%，参与分泌系统和宿主-病原体相互作用；eccA2、eccA3和mycP4在谱系3中突变率100%，是ESX系统分泌的关键保守序列；mce2A在谱系4中突变率100%，参与宿主细胞粘附和进入。86个基因突变率在谱系间存在差异，谱系2和谱系3突变基因数量显著多于谱系4，表明乌鲁木齐地区流行谱系间基因交换活跃，进化可能朝向毒力、传播力和耐药性增强方向发展。

影响治疗结局的因素分析发现，仅谱系2中espE、fadE29和mbtI基因突变显著影响患者治疗结局。espE基因突变可能增强EspB分泌或结合能力，提高MTB毒力；fadE29基因编码的异源酰基-CoA脱氢酶与细菌致病性和巨噬细胞内持久性相关，突变可能导致感染持续；mbtI基因编码的沙门酸合成酶参与铁载体生物合成，突变可能导致对MbtI抑制剂类药物的耐药性。耐药基因可能干扰谱系2中毒力基因与治疗结局的关系分析，需在分析中控制这一干扰。

本研究揭示了不同MTB谱系中毒力因子及其相关基因突变的差异，发现谱系2中espE、fadE29和mbtI基因突变是治疗不良结局的危险因素，为了解多谱系共存区域MTB毒力因子的进化、传播、耐药性和致病性提供了重要参考，对全球结核病防治、新药研发和实现WHO2035年消除结核病目标具有重要意义。下一步将基于本研究发现设计动物实验进一步验证。

结论

本研究揭示了乌鲁木齐地区不同MTB谱系中毒力因子及其相关基因突变的差异，发现谱系2中espE、fadE29和mbtI基因突变是治疗不良结局的危险因素。这些发现为了解多谱系共存区域MTB毒力因子的进化、传播性、耐药性和致病性提供了重要依据，对全球结核病防治、新药研发和实现WHO2035年消除结核病目标具有重要指导意义。