综述：快速PCR的热循环方法

本综述系统总结了实现快速PCR的多种热循环技术，涵盖接触式加热（如电阻/Peltier泵）、非接触加热（如红外辐射/等离子体激元）及空间域方法（如连续流/对流PCR）。文章深入分析了各技术的升温速率、灵敏度及商业化潜力，为开发高效、便携、低成本的快速核酸检测（POCT）系统提供了重要参考。

摘要

聚合酶链式反应（PCR）是核酸检测与定量中的关键技术。该反应需将反应混合物在两个或多个温度阶段之间进行约30次热循环，以实现目标DNA的指数级扩增。传统PCR热循环耗时约一小时，成为其应用的一大局限。本文综述了多种缩短热循环时间、实现快速PCR的方法，将其归为两类策略：一是提高局部加热/冷却功率，包括接触式加热（如加热电阻、帕尔贴泵）和非接触加热（如吹气、辐射加热与等离子体激元加热）；二是快速移动反应混合物至不同温区，涵盖反应容器移位、微流控芯片连续流PCR、长管或振荡流PCR以及对流PCR。文章分析了各方法的优势、挑战及评价技术的关键参数，回顾了技术进展与商业化现状，并讨论了构建高效、商业化快速PCR系统的当前挑战与未来方向，重点包括灵敏度、便携性与成本。

引言

核酸的快速精准传感对生物物质检测与定量至关重要。尽管存在多种核酸扩增与检测方法（如等温扩增与CRISPR技术），但PCR因其高准确性、高灵敏度及操作便捷性成为最主流方法。PCR反应需在精确控制的温度阶段间循环，耗时较长，尤其在即时检测（POCT）等场景中成为瓶颈。通过优化DNA聚合酶与缩短各阶段停留时间，温度变化速率成为PCR速度的主要限制因素。传统商用PCR系统升温速率约3–10°C/s，总反应时间约一小时。因此，提升热循环速度对缩短核酸检测时间至关重要。

快速热循环方法

提高热传导速率

接触式加热

将固体加热单元紧贴反应容器是最直接且常用的加热方式。该系统温度控制精准、易于构建，被多数传统PCR仪采用。为实现最大热传导速率，快速PCR设计通常采用小反应体积与增大热接触面积，并辅以材料优化与工程设计。

加热电阻因易于加工与集成至微系统而被广泛使用。反应多采用空气冷却，水冷却方案亦有报道。尤其对于100 nl PCR混合物覆盖1.1 μl矿物油的体系，电阻加热速率可达175°C/s（加热）与125°C/s（冷却），40次PCR循环仅需6分钟。商用qPCR系统（如BJS Technologies xxpress）可在10分钟内完成40次循环。

帕尔贴泵由N型与P型热电模块串联构成，通过电流方向与大小控制加热/冷却状态与速率。其体积小、效率高，可用于主动冷却，实现更高冷却速率。例如，采用聚碳酸酯（PC）蛇形容器与双侧帕尔贴泵，可在30分钟内完成30次循环，扩增221 bp大肠杆菌基因片段，灵敏度达10个细胞基因组。

反应容器设计对接触加热至关重要。传统PCR管多用聚丙烯（PP）等塑料，导热较慢。硅与玻璃材料导热性更优（见表1），硅基芯片可批量生产并集成传感器，玻璃则具透光性与低荧光特性。硅-玻璃芯片常用于快速PCR，液滴上样可实现数字检测，15分钟内完成PCR，检测限达10个核酸拷贝/测试。

为最大化加热速度，需将热能限域于反应区。绝缘沟槽设计可提升温度均匀性，实现细胞裂解与PCR的快速基因分型（如人CYP2C9基因SNP检测）。UF-qPCR系统采用类似设计，在5分钟内完成qPCR并实现4通道荧光检测，反应体积5 μl，检测限达单分子。该系统在低模板浓度下可进行单分子定位扩增，提升定量准确性。硅基芯片与绝缘沟槽设计已被miDiagnostics与Si-Gene Biotech等公司商业化。

非接触加热

非接触加热通过辐射等方式诱导热能，避免固体热传导，冷却多采用吹气。其避免了加热单元热质量大的问题，能效更高，且加热单元无需紧邻反应室，有助于减小设备尺寸与成本。

最早的非接触加热采用气流法，以不同温度空气加热聚丙烯管或毛细管。例如，玻璃毛细管中人DNA片段536 bp扩增可在15分钟内完成。辐射加热能更好聚焦能量于反应混合物，尤适于大体积样品。中红外与微波加热能提升PCR效率。

红外辐射（IR）将能量聚焦于水分子，钨灯与卤素灯是廉价IR源。采用钨灯辐射，每循环可缩短至17秒。激光加热低体积液滴可实现32°C/s升温速率（1 W，1480 nm激光）。特定液滴（20–100 nl）的IR激光加热可在370秒内完成40次循环。液滴打印于培养皿后，70 mW激光下40次循环需6分钟。红外激光加热液滴还可整合细胞裂解与定量PCR，15分钟内完成，适用于单细胞基因分型与数字PCR。AlphaHelix的αAmp PCR采用IR加热，20分钟内完成40次三步PCR，每轮处理24样本。

微波（300 MHz–300 GHz）易被水分子吸收，玻璃与塑料则不吸收。首例微波加热PCR于2003年开发，后续采用8–18 GHz行波管放大器实现65°C/s升温速率。1 W功率下可达40°C/s。感应加热则更均匀、精准，简单设计（如10 mm铜丝线圈）可实现6.5°C/s升温。Adelab Scientific的BMS-Mic PCR系统采用磁感应加热，25分钟内完成35次qPCR。

纳米材料（如金纳米结构）通过等离子体激元效应提升加热效率。纳米颗粒分散于溶液可实现均匀体积加热，并提升反应特异性。金纳米棒与808 nm激光联用，液滴加热与冷却时间分别缩短至200 ms与800 ms。高浓度纳米颗粒与蓝光LED配合，5 μl反应体积30次循环仅需150秒。激光加热下，10–25 μl反应30次循环可在1分钟内完成，升温速率>72°C/s。磁性核心纳米颗粒可快速移除以避免荧光干扰，30次循环<4.2分钟，并已用于SARS-CoV-2便携检测（40次循环/6分钟）。金属颗粒还可用于细菌裂解与产物检测。石墨烯氧化物光热加热微颗粒方案实现22.0±3.0°C/s与23.5±2.6°C/s升降温速率。GNA Biosolutions（现HP Health Solutions Germany GmbH）商业化金纳米颗粒辅助快速PCR，脉冲激光加热锚定于引物的金颗粒，局部加热大幅提升速度，实时定量PCR<10分钟。

等离子体材料（如金膜）作为反应容器部分可实现精准加热。LED加热120 nm金膜反应室底部，实现55°C/s升温与43.9°C/s冷却，30次循环/5分钟，各室可独立控温。双面金膜设计加热更快速均匀。多孔膜（如玻璃纤维沉积金）形成网状结构加热溶液，25次循环/6分钟。纳米多孔结构还可用于细菌富集，实现快速裂解与40次PCR/10分钟。纳米等离子体柱阵列（玻璃纳米柱上金岛结构）具宽带可见光吸收，结合微流控设计，升降温速率达11.95°C/s与7.31°C/s。掌上PCR系统可在400秒内完成40次循环。低成本碳黑材料近红外加热POCT设备，40次循环约9分钟。TiN环状光吸收器设计实现30次循环<200秒。Kryptos Biotechnologies开发薄膜光热效应PCR，样本至结果时间≤25分钟。

移动反应混合物

移位反应容器

直接移动整个反应容器至不同温区，通常采用电机驱动。相比直接接触加热，此法无需加热单元快速变温，但需机械运动。限制步骤常为预加热源（如水浴）至反应混合物的热传导，故采用小体积与高导热材料（如金属/玻璃）。

移动薄塑料管 between 水浴可实现~35°C/s升温，温度平衡约3秒，40次循环可在5分钟内完成，灵敏度达单模板分辨率。简易设计移动反应混合物 between 真空绝缘食品罐热水浴，实现17秒/循环。玻璃毛细管步进电机旋转 between 水浴，优化反应混合物后35次循环<20秒，为最快PCR。

大体积反应仍可快速进行。25 μl微流控室机械移动 between 三个温区，45次循环/9分钟。25 μl反应体系用于虾病原体检测，PCR管移动 between 水浴，样本至结果判断15分钟。50 μl锥形PCR管移动 between 105°C与10°C加热块，液体升降温速率达10.2°C/s与16.5°C/s。MBS NEXTGEN PCR移动整个PCR板至不同温区，超薄板可在2–10分钟内完成反应。

连续流PCR（CFPCR）

CFPCR通过外力驱动PCR混合物流经不同温区的流体通道，流动通常连续，也可采用水相-油相两相流。液体由泵或毛细力驱动，通道可为微流控芯片或长毛细管。反应时间由流速控制，常仅需数分钟，但流速过高可能降低效率与产量。延伸温度停留时间对效率至关重要。

常见设计为蛇形微流控通道 on 芯片，不同材料各具特色。玻璃芯片首见于1998年，三温区由铜块维持，20次循环需90秒至18.7分钟。硅的高热导性提升温度均匀性，集成电阻与传感器的全集成芯片25次循环/~5分钟，功耗12 W·h。印刷电路板（PCB）技术制作铜电阻芯片，30次循环<2分钟，功耗2.7 W。PDMS设备40次循环/160秒，并可实现多重扩增与通道并行化。3D系统优化流体阻力或温控。气泡问题可通过添加油相解决。其他材料如聚碳酸酯、PMMA、聚丙烯、聚酰亚胺亦有使用。低热导材料有时用于最大化热阻。

芯片CFPCR需精心设计以减少热串扰。柔性印刷电路（FPC）技术芯片实现高温度均匀性与低串扰，90 bp DNA模板30次循环/5分钟。加热单元形状影响均匀性，双层PCB技术制作蛇形加热器与热扩散器，两侧变性区提升均匀性，小系统37次循环/15分钟。流体通道优化可缩窄温区间通道宽度，2.1 cm长通道设计40次循环/9分钟。PDMS低热导性用于创建基于距离的温区，3D流体结构35次循环/15分钟。

螺旋设计引导反应经长管跨越不同温区，温区位于中心圆柱不同扇区或不同热浴。聚四氟乙烯（PTFE）管与薄膜加热器联用，33次循环/15分钟。毛细管可采用多螺旋结构提升加热均匀性。除PTFE外，Teflon与二氧化硅亦可用作管材。该设计易多重化，因多管可共享加热区。

CFPCR通道大表面积可能导致试剂吸附，需通过修饰壁面化学和/或添加添加剂减少吸附。静态钝化包括PDMS通道流动Tween 20、BSA或PVP，20% Tween 20效果最优。MPC基聚合物与硅烷偶联剂形成层减少气体渗透。其他材料静态钝化包括PTFE管流动BSA、二氧化硅硅烷化、PDMS使用Tween 20或BSA、环烯烃与聚烯烃聚合物用PCR混合物自身钝化。动态钝化添加PVP（2.5%）增加PDMS表面疏水性，30次循环/8–30分钟。BSA亦用于反应混合物钝化通道表面。Teflon螺旋通道设计与BSA钝化，25次循环/15分钟。常联合静态与动态钝化。

振荡流PCR采用更简单通道但更复杂流体控制系统，反应混合物置于跨越不同温区的容器（如毛细管），通过泵送、铁磁流体或设备旋转来回移动。铁磁流体驱动下，35次循环/200秒。可多重化并行反应，35次多重检测约13分钟。还能进行巢式PCR、多重PCR与熔解曲线测量。

总体CFPCR系统简单便携，但需精确控制液体流动，多重化反应较难，故更适用于医学检测与食品测试。Visby Medical商业化CFPCR用于传染病诊断，便携设备样本至答案约30分钟。

对流PCR

对流PCR利用Rayleigh-Bénard对流移动液体至不同温区，大幅降低仪器需求。液体流动可计算模拟与颗粒示踪，有潜力提升PCR速度与准确性。但因液体非以相同精确定速循环，循环数较不明确，常基于实测流速计算，定量应用如qPCR较难。

直管中对流PCR简单有效。最早对流在Plexiglas立方体中进行，两端水浴保持61°C与97°C，连续循环反应混合物。流动模式取决于立方体宽度。多孔系统可实现多重检测，191 bp流感片段扩增15分钟。玻璃毛细管对流PCR荧光定量方案中Ct值与模板浓度良好相关，显示定量潜力。常规微量管亦可进行对流PCR，40 μl反应体系20分钟内检测SARS-CoV-2。Ahram Biosystems开发对流PCR便携系统PalmPCR，10.5分钟检测沙门氏菌，24分钟鉴定肉类物种，当前Palm PCR?G2-12系统30次循环/9分钟。

容器物理倾斜影响对流效率。垂直放置聚合物毛细管底部加热可实现对流PCR，但水平放置流动更慢、温度更均匀，PCR更有效。30°倾角最有效，扩增15–20分钟，而水平或垂直需30分钟。

闭合流动系统提升效率，因各温区停留时间更确定。闭合流通常由环路引导，可倾斜调节流速。全集成对流PCR系统4反应并行，30次循环<5分钟。可整合样本制备模块，如磁珠纯化与三角形PTFE毛细管对流PCR，30分钟内检测细菌。环状PCR方案芯片两侧设95°C与60°C温区，对流PCR实现多重检测，产物通过芯片微阵列检测，样本制备后30分钟完成多重SNP基因分型。还可检测基因缺失。更微型化系统采用环烯烃聚合物微流控，离心力辅助下对流PCR约15分钟。

热循环在整体扩增程序中的集成

温度变化速率并非影响核酸定量速度的唯一因素，需整合样本制备、产物检测与整体简易性。多数样本需预处理（纯化与富集）。微颗粒与纳米颗粒用于病原体富集、细胞裂解与DNA/RNA纯化。磁珠可在PCR前移除或用于等离子体加热。膜与多孔结构（如硅膜、金涂层纳米多孔膜、氧化铝膜）用于集成样本制备与PCR。样本甚至可预扩增后再PCR检测。

产物检测传统采用凝胶电泳或毛细管电泳，但较耗时。光学检测实现快速或实时产物检测。荧光信号来自染料或荧光探针检测DNA产物。多重检测可采用多荧光团或芯片微阵列。吸收与拉曼光谱检测DNA产物免标记优势。更经济的侧流层析亦用于PCR产物检测。便携性通过微型化微流控系统提升，实现自动化样本至结果，应用于病毒检测、细菌病原体鉴定与SNP基因分型。手机替代专业相机减小设备尺寸与成本。便携电源与电池进一步缩小系统。阳光甚至可作为PCR加热源，虽加热慢，但促进欠发达地区现场PCR与可持续能源使用。

结论与展望

相比传统PCR约一小时，快速PCR系统大幅缩短反应时间。本文总结了不同快速PCR方法的优缺点。所有主要方法均已实现<10分钟反应，最快PCR仅<20秒完成35次循环。各主要方法均有商业化产品。未来先进PCR有望在20分钟内完成40次循环。等温扩增与CRISPR检测通常需20–30分钟检测低浓度样本，快速PCR可匹配此速度同时保持高特异性与准确性。

当前市场仍由传统PCR主导，反映快速PCR的挑战。首先，反应效率与灵敏度仍欠佳。尽管已有快速单分子灵敏度PCR报道，可靠扩增超低浓度模板仍难。反应混合物常需优化以实现速度与灵敏度，阻碍应用。其次，超快系统通常需昂贵耗材且难多重化，限制商业应用。传统qPCR采用成本效益高的PCR板，机器人自动化每板运行384反应。快速PCR的专用反应容器/试剂昂贵，鲜有报道并行处理超5样本。在成本与多重化非首要关心的场景（如快速检测与POCT），快速PCR已开始应用。但大规模筛查等场景中，快速热循环仍不敌多重性。因此，广泛适用快速PCR需可靠、高灵敏度、低成本系统。构建此类系统需创新开发廉价材料具所需热或等离子体性质，并设计稳健低成本的设备制造流程。克服这些挑战是确保快速PCR系统更广泛实施的关键步骤。