应用邻近连接鸟枪法宏基因组学探究粪菌移植后肠道微生物组中质粒与噬菌体动力学及其临床意义

本研究创新性地应用邻近连接鸟枪法宏基因组学（Proximity Ligation Shotgun Metagenomics）技术，追踪粪菌移植（FMT）治疗复发性艰难梭菌感染（rCDI）过程中供体细菌与噬菌体/质粒的动态互作，揭示噬菌体跨宿主传播现象及抗生素抗性基因（AMR）消长规律，为FMT机制研究与安全性评估提供关键方法论突破。

　　

引言

肠道微生物组作为具有多重生理功能的类器官结构，其功能恢复策略已成为研究热点。粪菌移植（Fecal Microbiota Transplantation, FMT）作为一种治疗复发性艰难梭菌感染（recurrent Clostridioides difficile infections, rCDI）的有效方法，其作用机制涉及细菌群落重建、次级胆汁酸代谢恢复以及噬菌体、细菌素等多重因素。传统宏基因组学技术对移动遗传元件（Mobile Genetic Elements, MGEs）与宿主细菌的关联分析存在局限性，而邻近连接鸟枪法宏基因组学通过甲醛交联固定技术，在DNA测序前建立细菌染色体与质粒/噬菌体间的物理连接，为精准解析宿主-元件关系提供技术突破。

结果

胶囊FMT恢复粪便微生物组中细菌与噬菌体多样性

30名rCDI患者在接受单次口服胶囊FMT后，27名实现临床治愈。通过对供体及84个粪便样本（移植前及移植后1-4周）的邻近连接宏基因组学分析，获得平均2.76亿碱基的组装长度和202个宏基因组组装基因组（Metagenome-Assembled Genomes, MAGs），覆盖86.3%的组装序列。细菌α多样性在移植后显著提升但未达到供体水平（供体香农指数=6.1），噬菌体α多样性同样呈现上升趋势，部分患者甚至超过供体多样性水平（香农指数=5.0）。统计学分析证实移植前后噬菌体多样性存在极显著差异（ANOVA, p=1.4×10^?8）。

移植后一周微生物群落与供体相似度提升

Bray-Curtis相似性分析显示，移植后细菌群落与供体的相似性随时间推移而增加，第二周和第四周样本与供体及自身移植前样本均呈现显著差异（Tukey HSD检验 adj. p<0.01）。噬菌体群落虽呈现类似趋势，但变化幅度较小且统计差异不显著，表明噬菌体群落的演替模式与细菌存在分化。

微生物组定植模式呈现患者特异性

细菌与噬菌体群落的β多样性分析揭示，同一患者移植后样本的相似性显著高于不同患者间样本，说明定植效果受个体原有菌群、饮食等宿主因素影响。从供体成功定植的67个细菌操作分类单元（bOTUs）和36个噬菌体操作分类单元（vOTUs）主要属于毛螺菌目（Lachnospirales）、振荡螺旋菌目（Oscillospirales）和拟杆菌目（Bacteroidales）。这些定植单元的丰度变异极大，例如拟杆菌目噬菌体#1328在患者中的相对丰度可达供体的6.2-79倍。

供体噬菌体定植并扩展宿主范围

通过DNA连接技术检测到32个供体来源vOTUs在受体中与细菌宿主的相互作用。部分噬菌体（如拟杆菌目噬菌体#1328与宿主细菌#344）保持专一性关联，但多数噬菌体与供体中未见的细菌新宿主建立连接。毛螺菌目和振荡螺旋菌目噬菌体普遍呈现跨宿主现象，例如振荡螺旋菌目噬菌体#157在17名患者中与5种不同细菌宿主互作，其中最常关联泛在肠道微生物Evtepia gabavorous（bOTU #425）。

FMT对耐药基因清除效果有限

共鉴定126个抗生素抗性基因（AMR），其中83%位于染色体，16%位于质粒，1%位于噬菌体基因组。供体及所有患者样本均检测到erm（核糖体甲基转移酶）、tet（四环素抗性）及lnu（林可酰胺核苷酸转移酶）基因。移植后细菌AMR基因定植率仅约4%。值得关注的是，两名患者移植前样本中检测到携带vanA基因盒（vanRSHAXYZ）的质粒（与肠球菌属相关），移植后该质粒未被检出。扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）基因（SHV, TEM-1, CTX-M, CMY）主要与肠杆菌目细菌染色体或质粒关联，FMT对其清除效果不一致：质粒编码的TEM-1基因在部分患者中消失或丰度降低，而染色体编码的SHV与CMY基因持续存在。

讨论

移动遗传元件（MGEs）作为细菌进化的重要驱动因子，既可能通过基因水平转移增强宿主适应性，也可能传播耐药性与毒力因子。本研究通过邻近连接宏基因组学技术，揭示FMT不仅实现供体细菌的定植，同时伴随供体噬菌体的转移——即使移植制剂为纯化微生物组分。值得注意的是，多数噬菌体在受体中与新宿主建立连接，提示FMT可能激活前噬菌体并诱导其跨宿主传播。尽管细菌多样性整体提升，但具体分类单元的定植效果存在显著个体差异，体现了宿主微环境对移植效果的调控作用。

耐药基因分析表明，FMT对vanA型万古霉素耐药质粒的清除具有积极作用，但对染色体编码的ESBL基因影响有限。这种差异可能与基因载体类型、宿主细菌特性及观察时间窗有关。未来需通过延长随访时间、优化供体选择、联合靶向抗生素等策略进一步提升FMT对耐药基因库的干预效果。

材料与方法

本研究经明尼苏达大学机构审查委员会批准（STUDY00003519）。患者接受标准化口服胶囊FMT（MTP-101C制剂），该制剂来自单一健康供体，包含约5×10¹¹个活菌。粪便样本采用DNA/RNA保护液保存，并通过Phase Genomics ProxiMeta Hi-C v4.0试剂盒进行文库构建。测序在Illumina NovaSeq平台上完成（PE150）。数据处理包括MEGAHIT组装、BWA-MEM比对、ProxiMeta分箱及GTDB-Tk分类注释。噬菌体和质粒contig分别通过VIBRANT和定制流程鉴定。AMR基因使用AMRFinderPlus注释，统计学分析基于Python的Scipy和Statsmodels库完成。